0030] 表1中，兼并堿基代碼R=A/G，D=A/G/T，Y=C/T，下劃線表示的是上、下游通 用引物序列；熒光染料Cy5標記上游通用引物標簽，下游引物不標記。根據(jù)實際檢測的病 原體的毒株不同以及GeXP系統(tǒng)（如GenomeLabTMGeXPGeneticAnalysisSystem毛細管 電泳儀）的誤差，使用上述引物對A-I及GeXP通用引物對檢測獲得的實際擴增產(chǎn)物長度可 在預(yù)計擴增產(chǎn)物的長度基礎(chǔ)上上下波動3bp。
[0031]實施例2 :多重PCR檢測體系的律立
[0032] 2. 1模板及含靶基因的單克隆質(zhì)粒標準品的制備
[0033]按照TaKaRa公司MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer. 5. 0(目錄號 DV819A)說明書從提取不同亞型（Hl-16和Nl-9)禽流感病毒和其他禽類病毒的核酸，獲得 50μL的核酸樣品，分裝置于-80°C保存。RT反應(yīng)體系參照TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄酶（目錄編 號D2639A)說明書進行，將獲得的RNA樣品分別按照如下反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行反轉(zhuǎn)錄， 得到cDNA;以DEPC水作為總RNA的對照。
[0034]反應(yīng)體系（25μL) :5X Reverse Transcriptase Buffer 5μL, 50mmol/L Random Primer(9mer)1μLndNTP Mixture(lOmM/L)2μL, 40U Ribonuclease Inhibitor 0.5μL，5U/μL MLV Reverse Transcriptase 0.5μL，模板RNA1μg，RNA_free水補足至 25μL〇
[0035] 反轉(zhuǎn)錄溫度42°C1. 5h，置于-20°C保存。用PCR分別擴增含有M、Hl、H2、H3、H5、 H6、H7、H9和H109個目的基因區(qū)域的片段，擴增后得到的的PCR陽性產(chǎn)物克隆到T-easy載 體中構(gòu)建成質(zhì)粒，經(jīng)測序證實這9個重組質(zhì)粒為T-easy載體分別插入了一種上述基因的重 組質(zhì)粒，且分別為上述9對引物對A-F的靶基因。
[0036] 2. 2使用單重RT-PCR法驗證引物
[0037] 2. 2. 1單重特異性引物（SP-Primer)稀釋至工作濃度1ymol/L，Cy5-Tag_F和 Tag-R稀釋至工作濃度10μmol/L。
[0038] 反應(yīng)總體積為 25μL，體系組分為：cDNA2· 0μL，10XPCRbuffer2· 5μL， MgCl2 (25mM/L) 2. 5μL,SingaJumpstartTaqpolymeraseL2μL(2. 5U/μL)(Singa公司， 目錄號：D4184)，dNTP(lOmM/L) 1μL(TaKaRa公司，目錄號：D4030RA)，特異性引物混合物取 1. 25μL，上、下游通用引物混合物取1. 25μL，最后用RNA-free水補足25μL。
[0039] 反應(yīng)條件為：94￡€511^11，然后941€3〇8,551€3〇8,72 1€3〇8，10個循環(huán)；941€3〇8， 65°C 30s，10個循環(huán)；94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s，20個循環(huán)；72°C延伸3min，置于4°C。
[0040] 2.2.2毛細管電泳
[0041] 使用GenomeLabGeXP遺傳分析系統(tǒng)的各PCR產(chǎn)物同時進行毛細管電泳檢測，操作 步驟如下：用甲酰胺為上樣緩沖液（美國貝克曼庫爾特公司，目錄編號608082)，DNAsize standardKit-400BasePairs(美國貝克曼庫爾特公司，目錄編號608098)與上樣緩沖液 按體積比1: (80-160)徹底混勻，在樣品板上每孔加入39μL混勻好的液體，用PCR產(chǎn)物進 行10-100倍稀釋，取稀釋后的產(chǎn)物1μL加至樣品板，吹打混勾，最后在每孔滴入一滴石蠟 油封閉，以免甲酰胺氧化和樣品蒸發(fā)。在緩沖液板上每孔加入2/3的緩沖液，進行毛細管電 泳。毛細管電泳的條件如下：毛細管升溫：溫度50°C;變性：90°C，120s;注入樣品：2. 0KV， 30s;分離：6. 0KV，35min。利用GenomeLabGeXP遺傳分析系統(tǒng)確定各型特異引物擴增片段 的實際檢測大小。
[0042] 2. 2. 3引物對A-G的單重特異性檢測
[0043] 用引物對A-G分別擴增實施例1中獲得的cDNA樣品：用引物對A擴增H5N1，引 物對B擴增H1N1,引物對C擴增H2N3,引物對D擴增H3N6,引物對E擴增H5N1，引物對 F擴增H6N8,引物對G擴增H7N2,引物對Η擴增H9N2,引物對I擴增H10N3。PCR擴增和 毛細管電泳的結(jié)果顯示單重特異性引物只對靶基因有良好擴增且未見有雜峰。不同靶基 因片段擴增后的大小范圍為：AIVΜ, 210-213bp;AIV-H1, 166-168bp;AIV-H2, 152-154bp; AIV-H3, 131-133bp;AIV-H5, 222-224bp;AIV-H6, 173-175bp;AIV-H7, 141-143bp; AIV-H9, 117-119bp;AIV-H10, 166-168bp。
[0044] 2. 3GeXP多重PCR體系的建立
[0045] 將引物對A、B、C、D、E、F、G、H和I混合成多重混合引物（Mix-Primer)工作液，通 過對引物濃度的優(yōu)化，使靶基因M、Hl、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10的引物在PCR反應(yīng)體 系中對應(yīng)的的摩爾濃度分別為 150nmol/L、100nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、100nmol/L、 100nmol/L、100nmol/L、100nmol/L、lOOnmol/L;通用引物Cy5-Tag-F和Tag-R在PCR反應(yīng)體 系中的摩爾濃度為500nmol/L。其余成分與引物驗證的相同。以多株已知病毒核酸的單一 陽性標本作為模板或多種病原的混合cDNA樣品作為模板，進行多引物PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序 及電泳與引物驗證的相同。
[0046] 2. 4 結(jié)果
[0047] 9對引物對A-Ι混合后分別對單一cDNA或混合cDNA進行檢測。
[0048] 如圖1所示，結(jié)果表明多引物單模版分別檢出了 118.Obp、131. 2bp、142. 7bp、 152. 3bp、167. 2bp、173. 54bp、190. 2bp、198. 5bp和 224. 6bp的擴增產(chǎn)物，陰性對照無任何擴 增產(chǎn)物；多引物多模板結(jié)果表明9個靶基因可被同時檢出，經(jīng)GeXPsystem多重檢測體系分 析，可檢出與實際相符的9個目的峰且無其他雜峰，同時可通過產(chǎn)物片段大小來區(qū)分所檢 測的禽流感病毒的主要流行亞型。結(jié)果也驗證了多重檢測檢測體系中的引物特異性。
[0049]實施例3:GeXPsystem多重檢測體系特異性檢測
[0050]按照MiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer. 5. 0說明書從尿囊液中分別 提取HA(1-16)和ΝΑ(1-9)亞型禽流感病毒核酸，同時提取IBV、NDV和ILTV等禽類常見病 毒的核酸分別加入到實施例2建立的GeXP多重檢測體系中，檢測該方法的特異性。多重 PCR完成后，PCR產(chǎn)物上機進行GeXP毛細管電泳分析，結(jié)果顯示每個反應(yīng)只出現(xiàn)特異信號， 無交叉反應(yīng)。擬基因除!11、!12、!13、!15、冊、!17、!19和!110外的其他擬亞型，以及燦￥、18￥、 ILTV和空白對照均無反應(yīng)信號，提示所建立的方法特異性強，與其他檢測對象無交叉反應(yīng)。
[0051]實施例4:GeXPsystem多重檢測體系的靈敏度試驗和檢測臨床樣本能力的分析
[0052] 4. 1GeXPsystem多重檢測體系的靈敏度試驗
[0053]用Promega公司RiboMAXTMLargeScaleRNAProductionSystem_T7 試劑盒（目 錄號P1300)按其說明書分別使用Spel和PvuII對實時例2中構(gòu)建的含有M、Hl、H2、H3、 H5、H6、H7、H9和H10基因的質(zhì)粒進行酶切，將上述9個含有不同目的基因線性化質(zhì)粒進行 體外轉(zhuǎn)錄合成RNA。利用DU800UV/Vis分光光度計對體外轉(zhuǎn)錄RNA濃度進行測定和定量。 根據(jù)核酸濃度和分子量計算RNA的拷貝數(shù)。將M、Hl、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10基因的 體外轉(zhuǎn)錄RNA等比例混合后進行10倍連續(xù)稀釋至106-10拷貝/μL。以稀釋產(chǎn)物為待檢測 樣品，以實施例2建立的方法進行GeXP多重檢測體系靈敏度的檢測與分析。試驗在不同日 重復(fù)3次。
[0054] 非同日的3次重復(fù)試驗表明，該方法對于M、Hl、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10基因 最低可以檢測至1〇〇拷貝/μL的核酸樣本。
[0055] 4. 2GeXPsystem多重檢測體系檢測臨床樣本的能力
[0056] 從實施例1隨機選擇主要流行亞型禽流感病毒的cDNA，經(jīng)實施例2中步驟二的方 法進行檢測。
[0057] 臨床單一感染H6亞型禽流感病毒的檢測結(jié)果見圖2,可以同時檢測出174. 36、 190. 82兩個目的峰且無其他雜峰，表明樣品中只含有H6亞型禽流感病毒的模板，與實際相 符。
[0058] 臨床單一感染H9亞型禽流感病毒的檢測結(jié)果見圖3,可以同時檢測出118. 6、 190. 66兩個目的峰且無其他雜峰，表明樣品中只含有H9亞型禽流感病毒的模板，與實際相 符。
[0059] 臨床單一感染H2亞型禽流感病毒的檢測結(jié)果見圖4,可以同時檢測出131. 23、 190. 9兩個目的峰且無其他雜峰，表明樣品中只含有H3亞型禽流感病毒的模板，與實際相 符。
[0060] 前述對本發(fā)明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述 并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進行很多改