的病毒載體，例如從1X105感染單位(IU)/ml病毒載體直至大約1X109感染單位(IU)/ml病毒載體。在具體的實施方式中，以約5 X105感染單位(IU)/ml生產(chǎn)病毒載體，以約6 X10 6感染單位(IU)/ml生產(chǎn)病毒載體，或者以約3X108感染單位(IU)/ml生產(chǎn)病毒載體。
【附圖說明】
[0027]圖1A?1D。用于純化本發(fā)明的慢病毒載體的示例方法的流程圖。
[0028]圖2。在無血清懸浮培養(yǎng)基中的適應(yīng)的HEK 293T細胞生長的表征。A:描述適應(yīng)CD293無血清培養(yǎng)基的細胞群體的光學顯微鏡圖，未觀察到聚集。B.使用旋轉(zhuǎn)瓶優(yōu)化細胞培養(yǎng)條件。在8%的0)2和每分鐘130轉(zhuǎn)的條件下，培養(yǎng)細胞四天，并且每毫升約3E+06個細胞。C.細胞生長速率與約20分鐘的倍增時間一致。
[0029]圖3。描述PEI轉(zhuǎn)染的HEK 293 T細胞在無血清懸和浮培養(yǎng)基中的eGFP表達的熒光顯微鏡圖像。A、B、C和D塊為在不同無血清培養(yǎng)介質(zhì)中的細胞。僅在D塊中檢測到eGFP陽性細胞。
[0030]圖4。描述PEI轉(zhuǎn)染的HEK 293 T細胞在無血清懸浮培養(yǎng)基中的eGFP表達的熒光顯微鏡圖像。A塊經(jīng)PEI 25，OOOkDa轉(zhuǎn)染；B經(jīng)PEI MAX (40，OOOkDa)轉(zhuǎn)染；C塊經(jīng)PEI pro轉(zhuǎn)染。PEI Max產(chǎn)生最高的轉(zhuǎn)染效率。
[0031]圖5。描述在無血清懸浮培養(yǎng)基中HEK 293 T的PEI轉(zhuǎn)染效率(A)和慢病毒載體轉(zhuǎn)導HEK 293細胞的熒光顯微圖。A塊用PEI MAX (40, OOOkDa)在優(yōu)化的條件下轉(zhuǎn)染；B塊顯示了慢病毒載體轉(zhuǎn)導(使用50ul的收獲的上清液)。
[0032]圖6。分析慢病毒載體由DEAE柱層析和PEG調(diào)節(jié)的DEAE柱層析回收。頂部的塊描述了來自柱層析流分的樣本的eGFP表達。A:色層分析不包含PEG調(diào)節(jié)；B、C和D包含使用4% PEG(4K) ,4% PEG(6K)和8% PEG(4K)的另外的洗滌步驟。100ul的每種流分用于轉(zhuǎn)導HEK293細胞，使用熒光顯微鏡和FACS(Bottom Panel)檢測eGFP陽性細胞。在洗脫流分中檢測到幾乎100%的慢病毒載體。
[0033]圖7。使用UV 280nm吸收分析慢病毒載體洗脫。在16ml DEAE瓊脂糖FF柱子上裝載30ml的澄清的慢病毒載體收集物。用PEG調(diào)節(jié)(B、C、D)或未經(jīng)PEG調(diào)節(jié)㈧來純化慢病毒載體。使用UV 280nm吸收對載體洗脫峰求積分，峰面積從5倍減小至幾乎20倍。有趣地注意到UV280/UV260的UV吸收比從UV280占優(yōu)勢(A塊)變化到UV 260占優(yōu)勢(B、C和D塊)，表明改善的載體純度。
[0034]圖8。SDS-PAGE分析從柱層析洗脫的慢病毒載體的純度。10 μ 1的每種樣本裝載在4?12% NuePage Bis_Tris凝膠上，并在電泳后銀染。洗脫A是來自未經(jīng)PEG調(diào)節(jié)的柱層析的慢病毒載體洗脫樣本；洗脫B、C和D為來自分別使用4% 4K PEG,4% 6K PEG和8%4K PEG的PEG調(diào)節(jié)的柱層析的洗脫流分。雖然對于所有這些洗脫的樣本慢病毒載體回收率具有高度可比性，但是在PEG調(diào)節(jié)的流分中的蛋白雜質(zhì)顯著減少。
[0035]圖9。FACS分析重組慢病毒載體的生產(chǎn)率。由12孔的板(1.5ml細胞培養(yǎng)基)或旋轉(zhuǎn)瓶(40ml細胞培養(yǎng)基)在無血清的懸浮細胞培養(yǎng)基中用優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方法生產(chǎn)表達eGFP的重組慢病毒載體。使用FACS分析確定載體產(chǎn)量。12孔板和旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)都觀察到每毫升高達6E+06轉(zhuǎn)導單位(TU)的載體生產(chǎn)率。
【具體實施方式】
[0036]研究中通常使用轉(zhuǎn)染方法生產(chǎn)重組慢病毒載體。在本領(lǐng)域中已知的幾種產(chǎn)生rLV病毒體的方法；例如，使用載體和rLV輔助序列轉(zhuǎn)染(參見，例如Merten等2011)。然而，當制造rLenti載體用于醫(yī)療用途時，尤其是用于后期階段的臨床應(yīng)用時，高度優(yōu)選使用無血清的懸浮生產(chǎn)系統(tǒng)制造所述載體，所述生產(chǎn)系統(tǒng)可放大(scaled up)，以確保充足的制造能力，并且確保制造的載體的優(yōu)異的安全性。
[0037]文中公開了基于轉(zhuǎn)染的生產(chǎn)方法，以在可擴展的無血清細胞培養(yǎng)基系統(tǒng)中生產(chǎn)高滴度的慢病毒載體。成功地使適于貼壁生長(adherent growth)的商業(yè)來源的細胞適應(yīng)到無血清的細胞培養(yǎng)基中。我們評估了多于五種不同的聲稱支持無血清懸浮細胞培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)基，但是僅鑒別了一種在適應(yīng)快的生長速率后支持非聚集的、健康細胞生長的培養(yǎng)基。在無血清懸浮培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)適應(yīng)的細胞幾個月，并研制了研究的細胞庫。
[0038]慢病毒為包膜病毒，并在病毒結(jié)構(gòu)和生命周期方面與其它用于遞送核酸到細胞中的病毒(例如腺相關(guān)病毒(AAV))有顯著的差別。慢病毒由2個拷貝RNA、核衣殼(NC)、衣殼(CA)、膜相關(guān)基質(zhì)(MA)，諸如表面糖蛋白和跨膜蛋白之類的包膜蛋白，以及酶，如整合酶(IN)、蛋白酶(PR)、逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的酶，和輔助蛋白(例如Nef、Vif、Vpu、Vpr)組成。慢病毒通過將所述病毒的表面糖蛋白結(jié)合到細胞上的受體來感染細胞。然后，病毒包膜的膜和細胞的膜融合，使病毒進入細胞。在進入后，發(fā)生病毒RNA的脫殼及逆轉(zhuǎn)錄，導致預(yù)集成復(fù)合物的形成，所述復(fù)合物包含雙鏈DNA、RT、IN、Vpr (或HIV-2中的Vpx)NC，以及一些拷貝的 MA (Suzuki and Craigie 2007, Depienne et al., 2000, Bukrinsky et al., 1993 andMiller et al.，1997)。一旦前病毒進入核包膜，病毒DNA在細胞基因組內(nèi)整合。轉(zhuǎn)錄和翻譯的正常細胞功能之后，結(jié)構(gòu)病毒蛋白與病毒RNA組裝，然后病毒出芽。
[0039]期望慢病毒部分地遞送核酸到細胞中，因為它們可通過核包膜主動地進入細胞核而感染非分裂的細胞。相反，其它逆轉(zhuǎn)錄病毒由于不能進入非分裂細胞的核包膜的事實，其針對感染需要細胞分裂。
[0040]“慢病毒”包括牛慢病毒組、馬慢病毒組、貓慢病毒組、羊慢病毒組和靈長類慢病毒組的成員。適于本發(fā)明的方法和用途的慢病毒的實例包括但不限于HIV以及它們的假型病毒，例如 HIV-l、HIV-2、HIV-l/HIV-2 假型病毒、HIV_1/SIV、FIV、羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病毒、牛免疫缺陷病毒和水皰性口炎病毒G-假型慢病毒(VSVG假型病毒)。[0041 ]在Klimatcheva et al., 1999, Frontiers in B1science 4:481-496 中論述了用于基因治療的慢病毒載體的發(fā)展。例如，在2001年3月27日公布的美國專利6，207，455以及2000年12月26日公布的美國專利6，165，782中描述了適于基因治療的慢病毒載體的設(shè)計和用途。例如，在Merten et al.(2011)中公開了另外的系統(tǒng)。
[0042]術(shù)語“gag多聚蛋白”、“pol多聚蛋白”和“env多聚蛋白”是指逆轉(zhuǎn)錄病毒gag、pol和env基因編碼的多聚蛋白，通常表達為單一前體“多聚蛋白”。例如，其它蛋白中，HIV gag編碼pl7、p24、p9和p6。其它蛋白中，HIV pol編碼蛋白酶(PR)、逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)和整合酶(IN) ο其它蛋白中，HIV env編碼Vpu、gpl20和gp41。如文中使用，術(shù)語“多聚蛋白”應(yīng)包括gag、pol和env多聚蛋白的全部或任何部分。
[0043]術(shù)語“Vpx”和“Vpr”分別指慢病毒Vpx和Vpr蛋白，例如在通過引用全部合并于此的W0 96/07741中描述。這些術(shù)語還指保留與p6相關(guān)的能力的Vpr與Vpx的片段、突變體、同系物和變種。
[0044]術(shù)語“融合蛋白”是指包含兩個或更多個連接到一起的蛋白的分子。通常，融合蛋白為包含2條或更多條蛋白序列的氨基酸序列。
[0045]“載體”是指遺傳元件，例如質(zhì)粒、■菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、染色體、病毒、病毒體等，當與適當?shù)目刂圃?lián)合時能夠復(fù)制，并可在細胞之間轉(zhuǎn)移基因序列。因此，術(shù)語包括克隆和表達載劑以及病毒載體。
[0046]如文中使用，術(shù)語“重組”作為例如載體之類的序列的改變以及病毒的改變，是指以通常天然未出現(xiàn)的方式操作(即工程化的)組合物。
[0047]“重組的慢病毒載體載體”或“rLV”是遺傳元件，包括慢病毒線性、雙鏈核酸基因組。通過例如添加或插入異源核酸構(gòu)建體已經(jīng)遺傳地改變慢病毒線性、雙鏈核酸基因組。
[0048]“重組病毒”意思是已經(jīng)遺傳地改變的病毒，例如，通過添加或插入異源核酸構(gòu)建物到所述顆粒中。重組病毒不包括傳染性的病毒，因為它們在自然中存在。
[0049]“LV病毒體”意思是完整的病毒顆粒，例如與rLV包膜相關(guān)的野生型(wt) LV病毒顆粒。“rLV病毒體”意思是完整的病毒顆粒，例如rLV病毒顆粒，包含與rLV包膜相關(guān)的感興趣的線性、雙鏈LV核酸基因組以及異源核苷酸序列。適于本發(fā)明的方法和用途的rLV的實例包括但不限于HIV及它們的假型病毒，例如HIV-l、HIV-2、HIV-l/HIV-2假型病毒、HIV-1/SIV、FIV、羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病毒、牛免疫缺陷病毒和水皰性口炎病毒G-假型慢病毒(VSVG假型病毒)。
[0050]文中限定術(shù)語“重組rLV病毒體”、“rLV載體顆?！币约啊叭Ｗ印睘閭魅拘缘膹?fù)制缺陷的病毒，包括rLV膜包膜、以及包括感興趣的異源核酸序列的轉(zhuǎn)基因。Dropulic (2011)提供了描述rLV分子特征的綜述。如文中說明，“重組的rLV病毒體”不包括傳染性LV，因為它們天然存在。
[0051]術(shù)語“宿主細胞”表示，例如微生物、酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞，可用作或者已經(jīng)用作rLV helper構(gòu)建物、rLV載體質(zhì)粒、輔助的功能載體或其它轉(zhuǎn)染DNA的受體。該術(shù)語包括已經(jīng)轉(zhuǎn)染的最初細胞的后代。因此，如文中使用的“宿主細胞”通常是指已用外源DNA序列轉(zhuǎn)染的細胞。應(yīng)理解，由于天然、偶然或有意的突變，單個親本細胞的后代可不必與最初的親本細胞在形態(tài)或基因組或總DNA互補(total DNA complement)上完全相同。
[0052]輔助功能載體通常是指包含提供輔助或協(xié)助功能的序列的核酸。輔助功能載體可被轉(zhuǎn)染到宿主細胞中，并且該載體可提供或編碼能支持在所述宿主細胞中/由所述宿主細胞進行的rLV載體病毒體生產(chǎn)的功能的蛋白質(zhì)。輔助功能載體可為質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、附加體或在宿主細胞的基因組中整合的形式。
[0053]使用術(shù)語“轉(zhuǎn)染”是指細胞對外源核酸(例如DNA)的吸收，并且當外源核酸(例如DNA)被引入到細胞膜內(nèi)時細胞已經(jīng)被“轉(zhuǎn)染”。本領(lǐng)域中通常已知一些轉(zhuǎn)染技術(shù)。參見，例如Graham 等(1973)Virology, 52:456，Sambrook等(1989)Molecular Cloning, a laboratorymanual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis等(1986)Basic Methods inMolecular B1logy, Elsevier, and Chu 等(1981)Gene 13:197。這樣的技術(shù)可用于引入一或多個外源DNA部分到合適的宿主細胞中。
[0054]如文中使用，術(shù)語“細胞系”是指在體外能夠連續(xù)或持續(xù)地生長和分裂的細胞群體。通常，細胞系為源自單一祖細胞的克隆群體。在本領(lǐng)域中進一步已知在儲存或轉(zhuǎn)移這樣的克隆群體期間在核型中可發(fā)生自發(fā)或誘導的變化。因此，源自細胞系的細胞是指可不必與祖細胞或培養(yǎng)物完全相同，并且所指的細胞系可包含這樣的變異體。
[0055]根據(jù)本發(fā)明的方法的適于無血清懸浮生長的細胞和細胞系包括哺乳動物細胞。示例的非限制細胞包括，例如 HEK 293T(ATCC)、HEK293F(Life Technologies)、HEK293 (ATCC)、293S(ATCC)、BHK(ATCC)、BHK-21 (ATCC)、CHO (ATCC)、CHO/dhFr- (ATCC) 1 和CHO K1 (ATCC)細胞。
[0056]可商購或制造根據(jù)本發(fā)明的方法使用的無血清細胞生長培養(yǎng)基。非限制的示例無血清生長培養(yǎng)基包括，例如 FreeStyle?293 (GibcoR, Life Technologies)、DMEM/F12(GibcoR, Life Technologies)、SFM4Transfx_293(HyClone?, ThermoScientific)、CDM4HEK293(HyClone?, Thermo