的紡錘體驅(qū)動(dòng)蛋白、慢性骨髓白血病中的凋亡抑制B細(xì)胞CLL/淋巴瘤(BCL-2)，實(shí)體瘤中的核苷酸還原酶M2 (RRM2)，實(shí)體瘤中的Furin ;肝臟腫瘤中Polo樣激酶1(PLK1)，丙型肝炎病毒感染中的二?；视王；D(zhuǎn)移1 (DGAT1)，在家族性腺瘤性息肉病中的β -連環(huán)蛋白；β 2-腎上腺素受體，青光眼；在糖尿病性黃斑水腫(DME)或年齡相關(guān)性黃斑變性中的RTP801/Reddl，還稱為DNA損傷誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子4蛋白；在年齡相關(guān)性黃斑變性或脈絡(luò)膜新生血管中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體I (VEGFR1)，非動(dòng)脈炎性缺血性視神經(jīng)病變中的半胱天冬酶2 ;在先天性厚甲中的角蛋白6A N17K突變蛋白；流感中的甲型流感病毒A基因組/基因序列在流感感染；SARS感染中的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)冠狀病毒基因組/基因序列；呼吸道合胞病毒感染中的呼吸道合胞病毒感染基因組/基因序列；埃博拉病毒感染中的埃博拉絲狀病毒基因組/基因序列；B型和C型肝炎病毒感染中的B型和C型肝炎病毒基因組/基因序列；HSV感染中的單純皰疹病毒(HSV)基因組/基因序列，在柯薩奇B3病毒感染中的柯薩奇病毒B3基因組/基因序列；在原發(fā)性肌張力障礙中的類扭轉(zhuǎn)蛋白A(TORIA)沉默致病等位基因(等位基因特異性沉默)，移植中的泛I類和HLA等位基因；常染色體顯性遺傳性視網(wǎng)膜色素變性(adRP)中的突變的視紫紅質(zhì)基因(RH0);或結(jié)合到任何上述基因或序列的轉(zhuǎn)錄本的抑制核酸。
[0087]當(dāng)“分離的”涉及核苷酸序列時(shí)，意思是表示的分子在相同類型的其它生物大分子實(shí)際缺少下存在。因此，“編碼特定多肽的分離的核酸分子”是指基本不含有未編碼主題多肽的其它核酸分子的核酸分子；然而，所述分子可包括一些對(duì)所述組合物的基本特征不產(chǎn)生不利影響的另外的堿基或部分。
[0088]除非另外限定，文中使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬的領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常理解相同的意義。雖然與文中描述的方法相似或等價(jià)的方法和材料可用于實(shí)施或檢測(cè)本發(fā)明，但是文中描述了合適的方法和材料。
[0089]文中公開的全部申請(qǐng)、公開、專利和其它引用、GenBank引用和ATCC引用通過(guò)引用整體合并于此。在沖突的情形下，將控制其說(shuō)明，包括定義。
[0090]可以任何組合組合文中公開的全部特征。說(shuō)明書中公開每個(gè)特征可被用于相同、等價(jià)或相似目的的替代特征代替。因此，除非另外明確表述，公開的特征(例如重組載體(例如rLV)載體、或重組病毒顆粒為等價(jià)或相似特征的種類的實(shí)例。
[0091]如文中使用，單數(shù)形態(tài)“一個(gè)”、“和”以及“所述”包括復(fù)數(shù)形態(tài)，除非文中另外清楚的表明。因此，例如，提及“一條多肽”包括多條這樣的多肽，提及“一個(gè)載體”包括多個(gè)這樣的載體，并且提及“一個(gè)病毒”或“顆?！卑ǘ鄠€(gè)這樣的病毒體/顆粒。
[0092]如文中使用，除非文中另外清楚地表明，否則全部數(shù)值或數(shù)值范圍包括在所述范圍內(nèi)的整數(shù)以及在范圍內(nèi)的所述值或整數(shù)的分?jǐn)?shù)，。因此，為了描述，提及的至少1-10%同一性包括 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，以及1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%等，2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%等。
[0093]提及的大于(超過(guò))或小于的數(shù)分別包括大于或小于所述提及的數(shù)的任何值。因此，例如提及的小于40，000，包括39，999、39，998、39，997等，一直減小到數(shù)1 (1);并且提及的小于100，包括99、98、97等，一直減小到數(shù)1(1)。
[0094]如文中使用，除非另外表明，否則全部的數(shù)值或范圍包括在這樣的范圍內(nèi)的值或整數(shù)的分?jǐn)?shù)，以及在這樣的范圍內(nèi)的整數(shù)的分?jǐn)?shù)。因此，為了描述，提及的數(shù)值范圍，例如 2，000-40，000，包括 2，000、3，000、4，000、5，000、6，000 等，以及 2，100、3，100、4，100、5，100、6，100 等。因此，提及的 20-100 的范圍包括 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40 等，多達(dá)并包括 100，以及 21.1、21.2、21.3、21.4、21.5 等，22.1、22.2、22.3、22.4、22.5 等。
[0095]提及的系列的范圍，包括組合所述系列內(nèi)不同范圍的邊界的值的組合。因此，為描述，提及的20-100或100-1,000的一系列的范圍(例如20mM-lOOmM或lOOmM-1M)包括 20-30、30-40、40-50、50-60、60_ ?75、75_100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1，000 等。
[0096]文中通常使用肯定的語(yǔ)言公開本發(fā)明，以描述許多實(shí)施方式和方面。本發(fā)明還特定地包括其中全部或部分排除特定主題的實(shí)施方式，例如物質(zhì)或材料、方法步驟和條件、方案或程序。例如，在本發(fā)明的某些實(shí)施方式和方面中，排除材料和/或方法步驟。因此，即使文中通常在本發(fā)明不包含的方面表達(dá)本發(fā)明，在本發(fā)明中未明確排除的這些方面仍然在文中被公開。
[0097]已經(jīng)描述了本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明做出各種變化和修改，以使它適應(yīng)各種用途和條件。因此，下面的實(shí)施例旨在描述而非限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1
[0098]通常在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(adherent cell culture system)中通過(guò)使用磷酸I丐沉淀方法的轉(zhuǎn)染方法生產(chǎn)慢病毒載體(3、4)。然而，當(dāng)為臨床應(yīng)用制造慢病毒載體，尤其是用于臨床應(yīng)用的后期階段時(shí)，在無(wú)血清的懸浮生產(chǎn)系統(tǒng)中制造載體是關(guān)鍵的，所述無(wú)血清的懸浮生產(chǎn)系統(tǒng)可擴(kuò)大(scaled up)，以確保載體生產(chǎn)的數(shù)量，并且增強(qiáng)制造的載體的安全性。
[0099]為克服當(dāng)前可用的慢病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)的現(xiàn)有限制，在文中公開的是產(chǎn)生高滴度的慢病毒載體的可擴(kuò)大的無(wú)血清、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。在該新的可擴(kuò)大生產(chǎn)系統(tǒng)中的第一步驟為研制可在無(wú)血清的條件下培養(yǎng)并產(chǎn)生高水平慢病毒載體的細(xì)胞系。我們假設(shè)使HEK293T細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基應(yīng)是可行的，因?yàn)檫@些細(xì)胞目前廣泛地用于生產(chǎn)病毒載體。為達(dá)到該目的，我們?cè)O(shè)計(jì)了逐步適應(yīng)方案，并系統(tǒng)地評(píng)價(jià)幾種商業(yè)可用的無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基，以及HEK 293T細(xì)胞在這些培養(yǎng)中強(qiáng)健地生長(zhǎng)的能力。發(fā)現(xiàn)一種培養(yǎng)基(⑶293)在適應(yīng)快速生長(zhǎng)速度后，在支持非聚集的健康細(xì)胞生長(zhǎng)方面優(yōu)于檢測(cè)的所有其它培養(yǎng)基(圖2，八塊)。優(yōu)化的細(xì)胞培養(yǎng)基條件支持高的細(xì)胞密度和一致的細(xì)胞生長(zhǎng)(圖2，B塊和C塊)。在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)適應(yīng)的細(xì)胞幾個(gè)月，并研制了研究的細(xì)胞庫(kù)。
[0100]已經(jīng)通過(guò)磷酸鈣沉淀共轉(zhuǎn)染2-5個(gè)質(zhì)粒到靶細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)慢病毒載體。雖然最新產(chǎn)生的多質(zhì)粒生產(chǎn)系統(tǒng)(自我激活系統(tǒng))已經(jīng)在產(chǎn)生具有減小的產(chǎn)生復(fù)制型慢病毒的風(fēng)險(xiǎn)的慢病毒載體方面顯示通用性，但是鈣共沉淀對(duì)大規(guī)模制造產(chǎn)生了限制。DNA的磷酸鈣共沉淀發(fā)展超過(guò)了 40年(5)，在研究的規(guī)模中對(duì)于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)有效。然而，其未提供在無(wú)血清懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中有效水平的轉(zhuǎn)染，并且非常難于擴(kuò)大。
[0101]聚乙烯亞胺(PEI)可商購(gòu)并檢測(cè)了用于有效引入質(zhì)粒DNA到新適應(yīng)的HEK 293T細(xì)胞出)。最初的實(shí)驗(yàn)揭示選擇用于無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基不支持任何使用PEI作為轉(zhuǎn)染劑的任何轉(zhuǎn)染，然后努力鑒定支持使用PEI的細(xì)胞轉(zhuǎn)染的無(wú)血清培養(yǎng)基。雖然篩選的一種特定的培養(yǎng)基類型支持轉(zhuǎn)染(圖3的D塊)，但是該培養(yǎng)基不支持長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)中的所述細(xì)胞的懸浮生長(zhǎng)(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)和開發(fā)了兩步驟的系統(tǒng)，以在無(wú)血清的懸浮液中產(chǎn)生慢病毒載體:首先，在支持在無(wú)血清條件下在懸浮液中強(qiáng)健和快速生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)細(xì)胞。其次，替換細(xì)胞培養(yǎng)基，或與支持基于PEI的轉(zhuǎn)染的第二培養(yǎng)基類型混合。為了優(yōu)化PEI轉(zhuǎn)染效率，評(píng)估了一些來(lái)自不同商品供應(yīng)商的PEI分子的不同形式。雖然在制造生物產(chǎn)品的一些情形下使用小分子量的線性PEI (例如25-kDa線性PEI) (6)，我們假設(shè)分支的PEI可呈現(xiàn)對(duì)多種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的更大的遞送效率，這是因?yàn)槊總€(gè)分子可用多個(gè)官能團(tuán)。在評(píng)估的不同PEI分子中，小分子分支的PE1、PEI MAX(40, OOOkDa, Polyscience,com)導(dǎo)致了在適應(yīng)的HEK 293T細(xì)胞在所述鑒定的培養(yǎng)基中的最高的轉(zhuǎn)染效率(圖4)。使用PEI MAX優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，獲得幾乎百分之一百的細(xì)胞轉(zhuǎn)染(圖5A塊)。我們初步的半定量數(shù)據(jù)表明在目前的生產(chǎn)方法中以每ml約1X106轉(zhuǎn)導(dǎo)單位產(chǎn)生慢病毒載體。就我們所有的知識(shí)而言，我們認(rèn)為我們實(shí)驗(yàn)室中改進(jìn)的技術(shù)代表在無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中第一個(gè)真實(shí)的可放大的慢病毒載體生產(chǎn)方法。
[0102]做出進(jìn)一步的努力以改善載體特定的生產(chǎn)率。評(píng)估參數(shù)，例如轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度、用于轉(zhuǎn)染的總DNA量、用于制備DNA/PEI復(fù)合物的方法、收獲載體的時(shí)間。在CD293培養(yǎng)基(添加4mM的谷氨酰胺)中培養(yǎng)所述適應(yīng)的HEK 293T細(xì)胞至3E+06/ml的密度；通過(guò)離心及重新懸浮或使用切向流過(guò)濾技術(shù)更換所述細(xì)胞培養(yǎng)基為SFM4Transfx-293 (添加4mM的谷氨酰胺)(HyClone?, ThermoScientific)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為每ml 1.5E+06個(gè)細(xì)胞，并在培養(yǎng)箱中孵化。對(duì)于旋轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)，使用130RPM/分鐘以及8%的C02?？傆?jì)12ug DNA用于轉(zhuǎn)染1.5E+06個(gè)細(xì)胞，并且4種質(zhì)粒的DNA摩爾比為1:1:1:1。使用Tris緩沖液以lmg/ml的濃度和調(diào)節(jié)至7.15的pH制備聚乙稀亞胺“MAX” (Polysciences, com)。以1:1的質(zhì)量比將DNA的混合物加入到PEI溶液，并且緩慢地混合溶液，并進(jìn)一步栓短暫培養(yǎng)；用5mM Tris溶液，pH 7.15進(jìn)一步稀釋混合的DNA/PEI混合物；稀釋的DNA/PEI溶液的終體積為待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物的介質(zhì)的1/15。然后，以1/15的體積比將DNA/PEI溶液加入到所述懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基，然后在轉(zhuǎn)染后48、72和96小時(shí)收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物介質(zhì)。然后，用收獲的細(xì)胞培養(yǎng)收獲物轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK 293細(xì)胞，并使用FACS分析eGFP的表達(dá)。觀察到更高的載體產(chǎn)生，在來(lái)自板(plates)和旋轉(zhuǎn)瓶的可更擴(kuò)大的細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)中產(chǎn)生超過(guò)6E+06TU/ml。
[0103]工業(yè)中廣泛地使用柱層析技術(shù)，以純化大規(guī)模的生物材料。目前通過(guò)離心技術(shù)沉淀載體(3)或通過(guò)柱層析技術(shù)(6)分離所述顆粒來(lái)純化慢病毒載體。當(dāng)使用e經(jīng)典離心技術(shù)時(shí)，基于柱層析的工藝解決在制造中的規(guī)模問(wèn)題，然而，分離高純度的慢病毒載體仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。在典型的陰離子交換柱層析中，裝載收獲的慢病毒載體到柱上，用低濃度的鹽(例如lOOmM的NaCl)洗滌，然而用高鹽緩沖液(650mM NaCl至1M NaCl)洗脫所述載體(6)。使用這種類型的層析技術(shù)共洗脫許多細(xì)胞蛋白(圖8，條2)。我們報(bào)道了用于腺相關(guān)病毒載體的純化的PEG調(diào)節(jié)的柱層析方法(7)，顯著地改善了從所述PEG調(diào)節(jié)的層析分離的rAAV載體的純度。我們假設(shè)PEG調(diào)節(jié)的層析還可應(yīng)用于從細(xì)胞蛋白分離慢病毒載體，增強(qiáng)載體的純度，因?yàn)樗龇蛛x是基于所述分子的大小，即使使用的樹脂不是尺寸排阻樹脂。
[0104]使用DEAE瓊脂糖Fast Flow樹脂研制了 PEG調(diào)節(jié)的柱層析方法。基于eGFP表達(dá)細(xì)胞的FACS分析，以大于95%的轉(zhuǎn)導(dǎo)單位從該方法回收慢病毒載體(圖5)，而載體純度比使用傳統(tǒng)柱層析的純度提高20倍(圖6和圖7)。雖然我們使用弱陰離子交換樹脂開發(fā)用于慢病毒載體的所述PEG調(diào)節(jié)的純化方法，我們認(rèn)為基于該方法的原理可應(yīng)用于任何柱層析樹脂，包括親和樹脂、強(qiáng)和弱的陰離子交換樹脂、強(qiáng)或弱的陽(yáng)離子交換樹脂以及其它樹月旨，只要所述載體結(jié)合到所述樹脂即可?；趧?chuàng)新的PEG調(diào)節(jié)的柱層析，設(shè)計(jì)和開發(fā)了完整的可放大(scalable)的純化方法。圖1中提供了文中描述的方法的流程圖。
[0105]上述技術(shù)為能夠制造充足量的高數(shù)量的rLenti載體的完全可放大的方法步驟，需要所述rLenti載體支持出現(xiàn)的令人興奮的臨床研究。意外地，所述方法和生產(chǎn)的rLV組合物超過(guò)了目前可用的慢病毒載體制造能力，并滿足了調(diào)查型產(chǎn)品品質(zhì)要求。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于大規(guī)模病毒載體純化的方法，所述方法包括: a)從無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基收獲重組病毒載體，所述重組病毒載體包括轉(zhuǎn)基因； b)通過(guò)過(guò)濾澄清步驟a)的收集物； c)收獲步驟b)的濾液，并且可選地核酸酶酶切所述濾液，以去除DNA/RNA雜質(zhì)； d)使步驟c)的濾液經(jīng)