過PEG調(diào)節(jié)的親和層析或離子交換柱層析，從而分離所述病毒載體； e)通過切向流過濾進一步純化從步驟d)獲得的所述病毒載體，以減小體積和更換緩沖液； f)使步驟e)的濾液經(jīng)過尺寸排阻柱層析，以進一步純化所述病毒載體； g)使步驟f)的所述載體經(jīng)切向流過濾，從而獲得最終的載體滴度；以及 h)通過過濾器過濾從步驟g)獲得的載體溶液，以及 i)收集所述純化的病毒載體。2.一種用于大規(guī)模病毒載體純化的方法，所述方法包括: a)從無血清懸浮培養(yǎng)基收獲包含轉(zhuǎn)基因的重組的病毒載體； b)通過過濾澄清步驟a)的收集物； c)使步驟b)的所述的澄清的懸浮液經(jīng)切向流過濾，以減小體積和更換緩沖液； d)收獲步驟c)的濾液，并且可選地核酸酶酶切所述濾液，以去除DNA/RNA雜質(zhì)； e)使步驟d)的所述濾液經(jīng)過PEG調(diào)節(jié)的親和層析或離子交換柱層析，從而分離所述病毒載體； f)使從步驟e)獲得的所述病毒載體經(jīng)過尺寸排阻柱層析，以進一步純化所述病毒載體； g)使步驟f)的所述載體經(jīng)切向流過濾，從而獲得最終的載體滴度；以及 h)通過過濾器過濾從步驟g)獲得的載體溶液；以及 i)收集所述純化的病毒載體。3.一種用于大規(guī)模病毒載體純化的方法，所述方法包括: a)從無血清懸浮培養(yǎng)基收獲包含轉(zhuǎn)基因的重組的病毒載體； b)通過過濾澄清步驟a)的收集物； c)使步驟b)所述的澄清的懸浮液經(jīng)切向流過濾，以減小體積和更換緩沖液； d)收獲步驟c)的濾液，并且可選地核酸酶酶切所述濾液，以去除DNA/RNA雜質(zhì)； e)使步驟d)的所述濾液經(jīng)過PEG調(diào)節(jié)的親和層析或離子交換柱層析，從而分離所述病毒載體； f)通過切向流過濾進一步純化從步驟e)獲得的所述病毒載體，以減小體積和更換緩沖液； g)使步驟f)的所述濾液經(jīng)過尺寸排阻柱層析，以進一步純化所述病毒載體； h)使步驟g)的載體經(jīng)切向流過濾，從而獲得最終的載體滴度；以及 i)通過過濾器過濾從步驟h)獲得的載體溶液，以及 j)收集所述純化的病毒載體。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述病毒載體為重組慢病毒載體(rLV) ο5.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述病毒載體包括選自HIV-1、HIV-2、HIV-1/HIV-2假型病毒、HIV-1/SIV、FIV、羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病毒、牛免疫缺陷病毒、HIV及它們的假型病毒、或水皰性口炎病毒G-假型慢病毒(VSVG假型病毒)載體的重組慢病毒載體(rLV)。6.一種rLV載體制劑，其包含在藥學(xué)可接受載體中的使用根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項的方法純化的rLV顆粒。7.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)基因編碼選自由siRNA、反義分子以及miRNA、核糖酶和shRNA組成的組中的核酸。8.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)基因編碼選自由胰島素、胰高血糖素、生長激素(GH)、甲狀旁腺激素(PTH)、生長激素釋放因子(GRF)、卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管生成素、血管抑素、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、促紅細胞生成素(EPO)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α (TGF-α)、血小板衍生生長因子(TOGF)、胰島素樣生長因子I和II(IGF-1和IGF-1I)、TGF-β、激活素、抑制素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、神經(jīng)生長因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子NT-3和NT4/5、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)、neurturin,聚集蛋白、紡錘蛋白_1和紡錘蛋白-2、肝細胞生長因子(HGF)、肝配蛋白、頭蛋白、sonic hedgehog和酪氨酸輕化酶組成的組中的基因產(chǎn)物。9.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)基因編碼選自由血小板生成素(TP0)、白細胞介素(IL 1至IL-17)、單核細胞趨化蛋白、白血病抑制因子、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、Fas配體、腫瘤壞死因子α和β、干擾素α、β和γ、干細胞因子，f lk-2/f lt3配體、IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，嵌合免疫球蛋白、人源化抗體、單鏈抗體、T細胞受體、嵌合Τ細胞受體、單鏈Τ細胞受體、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)、CCR5和I類和II類MHC分子組成的組中的基因產(chǎn)物。10.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)基因包括編碼用于矯正先天性代謝缺陷的蛋白質(zhì)的核酸，所述蛋白選自由氨甲酰合成酶1、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羥化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、膽色素原脫氨酶、因子V、因子VII1、因子IX、胱硫醚-β -合成酶、支鏈酮酸脫羧酶、白蛋白、異戊酰輔酶Α脫氫酶、丙酰輔酶A羧化酶、甲基丙二酸單酰輔酶A變位酶、戊二酰輔酶A脫氫酶、胰島素、β-葡萄糖苷酶、丙酮酸羧酸鹽、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脫羧酶、視網(wǎng)膜色素上皮細胞特異性65kDa蛋白(RPE65)、Η蛋白、Τ蛋白、囊性纖維化跨膜調(diào)控子(CFTR)序列和肌營養(yǎng)不良蛋白cDNA序列組成的組中。11.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)基因編碼選自因子VIII和因子IX的基因產(chǎn)物。12.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)基因編碼與腫瘤相關(guān)的抗原(ΤΑΑ)ο13.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)基因編碼選自由CAIX，CD19，CD20，CD20，CD22，CD30，CD33，CD44v7/8，CEA，EGF-RIII (表皮生長因子受體型突變體 3)EGP-2，erb-B2, erb_B2、erb_B3、erb_B4，F(xiàn)BP，胎兒型乙酰膽堿受體，⑶2，Her2/neu,IL-13R-a2，KDR，k輕鏈，LeY，LI細胞粘附分子，MAGE-A1，間皮素，MUC1，NKG2D，癌胚抗原(h5T4)，PSCA，PSMA，靶向TAA的mAb IgE, TAG-72或VEGF-R2組成的組中的基因產(chǎn)物。14.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，由哺乳動物細胞產(chǎn)生所述重組的病毒載體。15.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述重組病毒載體由HEK293T (ATCC)、HEK293F (Life Technologies)、HEK293 (ATCC)、293S (ATCC)、BHK (ATCC)、BHK-21 (ATCC)、CHO (ATCC)、CHO/dhFr- (ATCC) 1 或 CHO K1 (ATCC)細胞產(chǎn)生。16.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述無血清懸浮培養(yǎng)基包括無血清的細胞生長培養(yǎng)基。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述無血清懸浮培養(yǎng)基選自:FreeStyle?293 (GibcoR, Life Technologies)、DMEM/F12 (GibcoR, Life Technologies)、SFM4Transfx-293(HyClone?, ThermoScientif ic)、CDM4HEK293(HyClone?,ThermoScientific)、StemPro-34SFM (GibcoR, Life Technologies)、FreeStyle F17 (GibcoR, LifeTechnologies)、293SFM 11 (GibcoR, Life Technologies)和 CD293 (GibcoR, LifeTechnologies)。18.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述核酸酶包括核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶或它們的組合。19.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述核酸酶包括脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶或它們的組合。20.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述核酸酶包括全能核酸酶或脫氧核糖核酸酶。21.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述離子交換柱層析包括陰離子交換柱層析。22.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述離子交換柱層析包括強陰離子交換柱層析或弱陰離子交換柱層析。23.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述離子交換柱層析包括陽離子交換柱層析。24.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述離子交換柱層析包括強陽離子交換柱層析或弱陽離子交換柱層析。25.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述離子交換柱包括基于季銨化聚乙烯亞胺的樹脂或基于季銨的樹脂。26.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述離子交換柱包括基于聚乙烯亞胺的樹脂、基于一■乙氣基乙基(DEAE)的樹脂或基于一■乙氣基丙基的樹脂。27.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述親和柱包括基于磺丙基的樹脂。28.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述親和柱包括基于羧甲基的樹脂。29.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述親和柱包括多官能層析樹脂。30.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述親和柱或離子交換柱包括基于羥基磷灰石((Ca5(P04)30H)2)的樹脂；多峰弱陽離子交換樹脂、基于N-芐基-η-甲基乙醇胺的樹脂或基于辛胺的樹脂。31.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述親和柱包括金屬螯合親和樹脂、基于肝素的樹脂或基團特異的親和樹脂。32.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述PEG調(diào)節(jié)的親和或離子交換柱層析包括: i)調(diào)節(jié)步驟c)的所述濾液為結(jié)合溶液，并使所述濾液與上述親和或離子交換柱接觸，從而使所述病毒載體結(jié)合到上述親和或離子交換柱，其中，所述結(jié)合溶液可選地包括PEG， ?)洗滌所述結(jié)合的病毒載體，以用包含PEG的洗滌溶液或包含PEG和鹽的洗滌溶液去除雜質(zhì)；以及 iii)用洗脫液從所述親和或離子交換柱洗脫所述病毒載體。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述結(jié)合溶液包含約0%-10%重量/體積、或約0% -5%重量/體積、或約0% -2%重量/體積的PEG。34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述結(jié)合溶液包含具有約2，000kDa至約40，OOOkDa的分子量的PEG。35.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述洗滌溶液包含約1%-10%重量/體積或約1% ~5%重量/體積或約1 % -2%重量/體積的PEG。36.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述洗滌溶液包含具有約2，OOOkDa至約40，OOOkDa的分子量的PEG。37.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述洗脫液包含約0% -20 %重量/體積的PEG。38.如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述洗脫液包含具有約2，OOOkDa至約40，OOOkDa的分子量的PEG。39.根據(jù)權(quán)利要求32-38的任一項所述的方法，其中，所述結(jié)合溶液、洗滌溶液或洗脫液進一步包含鹽。40.根據(jù)權(quán)利要求32-38的任一項所述的方法，其中，所述洗脫溶液包含約500mM至約l，000mM的量的鹽。41.根據(jù)權(quán)利要求39或40所述的方法，其中，所述鹽包括氯化鈉或氯化鉀。42.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述步驟h)或i)的所述過濾是通過具有約.20-0.5um的孔徑的過濾器。43.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述步驟g)的所述過濾是通過.20um孔徑的過濾器。44.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述步驟g)的所述過濾是通過.22um孔徑的過濾器。45.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，所述步驟g)的所述過濾是通過.45um孔徑的過濾器。46.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，以約5X 10 5感染單位(IU) /ml生產(chǎn)所述病毒載體。47.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，以約6X 10 6感染單位(IU) /ml生產(chǎn)所述病毒載體。48.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項所述的方法，其中，以約3X 10 8感染單位(IU) /ml生產(chǎn)所述病毒載體。
【專利摘要】提供用于以滿足人類基因治療的預(yù)期需要的規(guī)模制備高純度rLV載體制劑的方法。
【IPC分類】C12N7/02
【公開號】CN105378074
【申請?zhí)枴緾N201480016236
【發(fā)明人】曲光, 約翰·弗雷澤·萊特
【申請人】費城兒童醫(yī)院
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2014年3月17日
【公告號】CA2904366A1, EP2970920A1, US20140323556, WO2014145578A1