一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的引物、試劑盒和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的引物、試劑盒和檢測(cè) 方法，屬分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 斑點(diǎn)叉尾鮰病毒（Channel catfish virus，CCV)是一種有囊膜的雙鏈DNA病 毒，又稱鮰皰疹病毒I型（Ictalurid herpesvirus 1)，國(guó)際病毒分類委員會(huì)第八次報(bào)告 的最新病毒分類系統(tǒng)將其歸類為皰疹病毒科、鮰病毒屬。該病毒引起的斑點(diǎn)叉尾鮰病毒病 (Channel catfish virus disease，CCVD)是一種急性致死性傳染病，可導(dǎo)致斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng) 殖產(chǎn)業(yè)的嚴(yán)重?fù)p失，我國(guó)將其列為《中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物一、二類傳染病、寄生蟲(chóng)病名 錄》的二類傳染病。斑點(diǎn)叉尾鮰和其他鮰對(duì)CCV易感，天然水體中病毒只感染鮰幼魚(yú)和魚(yú) 苗，剛孵化育苗死亡率達(dá)100%。此病主要在北美流行，我國(guó)近年來(lái)大規(guī)模養(yǎng)殖斑點(diǎn)叉尾鮰， 但目前還未有CCV的確切報(bào)道。CCVD流行后，殘存魚(yú)往往是隱形帶毒者，一般無(wú)臨床癥狀。 建立CCV的快速檢測(cè)預(yù)警技術(shù)，加強(qiáng)斑點(diǎn)叉尾鮰苗種和成魚(yú)類檢疫以及養(yǎng)殖水體環(huán)境的監(jiān) 測(cè)，對(duì)預(yù)防病毒感染，有效切斷病毒傳播，保障斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展具有重要 意義。
[0003] 目前為止，CCV檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法主要是用細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒，然后用中和試驗(yàn)、免 疫熒光、ELISA或PCR等手段進(jìn)行鑒定，對(duì)無(wú)臨床癥狀的魚(yú)感染CCV的判定是用血清學(xué)的方 法，通過(guò)測(cè)定魚(yú)CCV抗體。血清學(xué)方法敏感性較低；PCR方法雖然靈敏，但仍會(huì)有假陽(yáng)性出 現(xiàn)的可能；其他方法不能達(dá)到在分子水平上進(jìn)行快速確證的目的。
[0004] 焦磷酸測(cè)序技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，適于 對(duì)已知短序列的測(cè)序分析，無(wú)需熒光標(biāo)記引物或核酸探針，無(wú)需電泳，具有分析快速、準(zhǔn)確、 靈敏度高、經(jīng)濟(jì)、自動(dòng)化和實(shí)時(shí)檢測(cè)的特點(diǎn)。該方法在普通PCR的基礎(chǔ)上，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行 測(cè)序，提高了檢測(cè)的特異性，且給出了分子診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)一基因序列，減少了由于PCR敏 感性高而出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。焦磷酸測(cè)序技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行 短DNA序列分析，通量高、操作方便，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，因而頗受國(guó)內(nèi)外研究者的 歡迎，已廣泛應(yīng)用于病原微生物快速鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一組利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒 的引物。
[0006] 本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾 鮰病毒的試劑盒。
[0007] 本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾 鮰病毒的檢測(cè)方法。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的主要原理是利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)，通過(guò)DNA聚合酶 (DNA ploymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶（ATP sulfurylase)、焚光素酶（Iuciferase)和 雙磷酸酶（apyrase) 4種酶催化待測(cè)序DNA單鏈和測(cè)序引物的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，反應(yīng)底 物為5'-鄰酰硫酸（adenosine5'phosphosulfate，APS)和焚光素。在每一輪測(cè)序反應(yīng)中， 加入1種dNTP，若該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾 數(shù)的焦磷酸基團(tuán)（PPi)。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驅(qū)動(dòng)熒光素酶介導(dǎo)的熒光 素向氧化熒光素的轉(zhuǎn)化，發(fā)出與ATP量成正比的可見(jiàn)光信號(hào)，光信號(hào)由CCD攝像機(jī)檢測(cè)并由 Pyrogram?反應(yīng)為峰，每個(gè)光信號(hào)的峰高與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。ATP和未摻入 的dNTP由雙磷酸酶降解，淬滅光信號(hào)，并再生反應(yīng)體系，然后加入下一種dNTP。最終待測(cè)序 列順序即可從反應(yīng)光強(qiáng)的信號(hào)峰中讀出。
[0009] 本發(fā)明提供了一組利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的引物，包括擴(kuò)增引 物對(duì)和測(cè)序引物：
[0010] 擴(kuò)增引物對(duì)：上游引物：5' -GGCTTGGGCTTGATGGAC-3'（SEQ ID No. 2)
[0011] 下游引物：5,-Biotin-GAGGAGGACAACGCGACTG-3'（SEQ ID No. 3)
[0012] 測(cè)序引物：5'-CTTGGGCTTGATGGA-3'（SEQ ID No. 4)
[0013] 其中，下游引物的5'端標(biāo)記生物素。
[0014] 本發(fā)明所述的斑點(diǎn)叉尾鮰病毒特異性引物及焦磷酸測(cè)序引物是根據(jù)斑點(diǎn)叉尾鮰 病毒蛋白激酶（protein kinase，PK)基因的保守區(qū)域序列，通過(guò)Assay Design SW軟件設(shè) 計(jì)的，以擴(kuò)增出特異性單一條帶，再根據(jù)擴(kuò)增區(qū)域中包含的特異核苷酸序列（特異目標(biāo)序 列SEQ ID No. 1所示）設(shè)計(jì)焦磷酸測(cè)序引物以確定斑點(diǎn)叉尾鮰病毒。斑點(diǎn)叉尾鮰病毒PK 基因的目標(biāo)序列：CCGGTCGTGT CGGTGTCGGT GGCTGTGTCG GCTTCCGTTT CACCG(SEQ ID No. 1); 其PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為144bp。
[0015] 本發(fā)明還提供一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的試劑盒，該試劑盒 包括上述檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的引物組，即擴(kuò)增引物對(duì)和測(cè)序引物。進(jìn)一步地，該試劑盒 還包括完成PCR反應(yīng)和焦磷酸測(cè)序所需材料和試劑，例如DNA提取試劑（可以按照現(xiàn)有技 術(shù)中公開(kāi)的方法自行配制，也可以使用商業(yè)化購(gòu)買的試劑盒）；PCR反應(yīng)試劑（可以按照現(xiàn) 有技術(shù)中公開(kāi)的方法自行配制，也可以使用商業(yè)化購(gòu)買的試劑盒）；單鏈模板制備試劑；焦 磷酸測(cè)序試劑（可以按照現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)的方法自行配制，也可以使用商業(yè)化購(gòu)買的試劑 盒）等，上述材料和試劑可以混合包裝，也可以單獨(dú)包裝，優(yōu)選地，為單獨(dú)包裝。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的檢測(cè)方法，該方 法包括：
[0017] (1)提取待測(cè)樣品DNA作為模板，可以使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的提取方法或商業(yè)化 試劑盒進(jìn)行提?。?br>[0018] (2)使用上述擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0019] (3)若斑點(diǎn)叉尾鮰病毒特異PCR反應(yīng)為陽(yáng)性，即擴(kuò)增片段為144bp，則回收PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物，制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板，然后使用上述測(cè)序引物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，若目的序列與 CCGGTCGTGT CGGTGTCGGT GGCTGTGTCG GCTTCCGTTT CACCG(SEQ ID No.l)特異目標(biāo)序列一 致，則待測(cè)樣品中含有斑點(diǎn)叉尾鮰病毒；若斑點(diǎn)叉尾鮰病毒特異PCR反應(yīng)為陰性，則判定樣 品為非斑點(diǎn)叉尾鮰病毒。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒進(jìn)行檢測(cè)，與現(xiàn) 有技術(shù)相比，該技術(shù)具有高通量、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可以精確的進(jìn)行短DNA序列分析，測(cè)序 過(guò)程耗時(shí)短，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程。PCR產(chǎn)物可直接用于測(cè)序，不需進(jìn)行產(chǎn)物純化等二 次處理，操作簡(jiǎn)便，所需樣品量少。
[0021] 下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，凡依照本發(fā)明公開(kāi) 內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為本發(fā)明對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；其中M 為DNA Marker，1為斑點(diǎn)叉尾鮰病毒，2為陰性對(duì)照。
[0023] 圖2為本發(fā)明對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的結(jié)果。
[0024] 圖3為本發(fā)明對(duì)樣品組織DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果；其中 M為DNA Marker，1為斑點(diǎn)叉尾鮰病毒感染的鮰魚(yú)組織樣品，2為正常鮰魚(yú)樣品，3為陰性對(duì) 照。
[0025] 圖4為本發(fā)明對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒感染的鮰魚(yú)組織DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果。
[0026] 圖5為本發(fā)明對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序的敏感性檢測(cè)結(jié) 果。其中，A-G依次為斑點(diǎn)叉尾鮰病毒模板從IO 1稀釋至10 7PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的焦磷酸測(cè)序檢 測(cè)結(jié)果。
[0027] 圖6為本發(fā)明對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒進(jìn)行PCR擴(kuò)增特異性檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié) 果。其中M為DNA Marker，1為斑點(diǎn)叉尾鮰病毒，2為金魚(yú)造血器官壞死病毒，3為錦鯉皰疹 病毒，4為流行性造血器官壞死病毒，5為甲魚(yú)虹彩病毒，6為陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 實(shí)施例1檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的引物的設(shè)計(jì)