)，每輪測(cè)序檢測(cè)運(yùn)行時(shí)間為65min，引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸， 隨著核酸的結(jié)合，CCD攝像機(jī)檢測(cè)到發(fā)出的光信號(hào)，感染CCV的鮰魚組織DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物焦磷酸測(cè)序結(jié)果見圖4,讀取的序列為CGGTCGTGT CGGTGTCGGT GGCTGTGTCG GCTTCCGTTT CACCG(SEQ ID No. I)〇
[0065] 6、結(jié)果判定
[0066] PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果表明斑點(diǎn)叉尾鮰病毒感染的鮰魚組織擴(kuò)增出了 144bp目的片 段，與CCV的檢測(cè)結(jié)果一致；經(jīng)過焦磷酸測(cè)序，測(cè)定的目的序列與斑點(diǎn)叉尾鮰病毒PK基因 的特異目標(biāo)序列一致，為 CGGTCGTGT CGGTGTCGGT GGCTGTGTCG GCTTCCGTTT CACCG(SEQ ID No. 1)，因此可判定1號(hào)樣品為斑點(diǎn)叉尾鮰病毒感染。正常鮰魚組織未擴(kuò)增出144bp的目的 片段，因此可判定2號(hào)樣品中無斑點(diǎn)叉尾鮰病毒。
[0067] 實(shí)施例5利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的敏感性實(shí)驗(yàn)
[0068] 以實(shí)施例3中提取的CCV DNA為模板，依次進(jìn)行10倍比稀釋至10 7,同時(shí)設(shè)陰性 對(duì)照。采用實(shí)施例3中的步驟進(jìn)行敏感性檢測(cè)。
[0069] I、PCR反應(yīng)體系及條件
[0070] PCR反應(yīng)體系及條件參見實(shí)施例3的相應(yīng)步驟。以稀釋的病毒DNA為模板，用 PyroMark PCR Kit(QIAGEN公司，貨號(hào)978703)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系、反應(yīng)程序均參見 實(shí)施例3。
[0071] 3、瓊脂糖凝膠電泳
[0072] 電泳方法參見實(shí)施例3的步驟3。
[0073] 4、制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板
[0074] 方法參見實(shí)施例3的步驟4。
[0075] 5、焦磷酸測(cè)序
[0076] 在焦磷酸測(cè)序儀（PYROMARK Q96)上進(jìn)行反應(yīng)，在20_28°C下，所采用的堿基加入 順序?yàn)?5 (ATGC)，每輪測(cè)序檢測(cè)運(yùn)行時(shí)間為65min，引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸，隨 著核酸的結(jié)合，CCD攝像機(jī)檢測(cè)到發(fā)出的光信號(hào)，CCV DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物焦磷酸測(cè)序結(jié)果見 圖 5,讀取的序列為 CGGTCGTGT CGGTGTCGGT GGCTGTGTCG GCTTCCGTTT CACCG (SEQ ID No. 1)。
[0077] 6、結(jié)果判定
[0078] 電泳結(jié)果表明CCV DNA模板從10 1稀釋至10 7后仍擴(kuò)增出144bp的目的片段，條 帶亮度逐漸減弱；經(jīng)過焦磷酸測(cè)序，CCV DNA模板稀釋至10 6,測(cè)定的CCV目的序列與PK基 因的特異目標(biāo)序列一致，為 CGGTCGTGT CGGTGTCGGT GGCTGTGTCG GCTTCCGTTT CACCG (SEQ ID No. 1);稀釋至10 7時(shí)，經(jīng)焦磷酸測(cè)序未測(cè)出特異目標(biāo)序列。本實(shí)施例說明本發(fā)明建立的利 用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的方法敏感性較強(qiáng)，可稀釋至10 6,即20TCID5。。
[0079] 實(shí)施例6利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的特異性實(shí)驗(yàn)
[0080] 分別提取金魚造血器官壞死病毒（GFHNV)、錦鯉皰疹病毒（KHV)、流行性造血器官 壞死病毒（EHNV)和甲魚虹彩病毒（STIV)的DNA (均為本實(shí)驗(yàn)室保存），以實(shí)施例3中提取 的CCV DNA為陽性對(duì)照，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。采用實(shí)施例3中的步驟進(jìn)行特異性檢測(cè)。
[0081] 1、病毒樣品DNA的提取
[0082] 采用 DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN 公司，69506)提取病毒 DNA，試劑盒操作 步驟參見實(shí)施例3的步驟1。
[0083] 2、PCR反應(yīng)體系及條件
[0084] 以提取的病毒和對(duì)照病毒樣品DNA為模板，用PyroMark PCR Kit (QIAGEN公司， 978703)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系、反應(yīng)程序均參見實(shí)施例3的步驟2。
[0085] 3、瓊脂糖凝膠電泳
[0086] 電泳方法參見實(shí)施例3的步驟3。本實(shí)施例的電泳結(jié)果見圖6。
[0087] 4、制備焦磷酸測(cè)序單鏈模板
[0088] 方法參見實(shí)施例3的步驟4。
[0089] 5、焦磷酸測(cè)序
[0090] 在焦磷酸測(cè)序儀（PYROMARK Q96)上進(jìn)行反應(yīng)，在20-28°C下，所采用的堿基加入 順序?yàn)?5 (ATGC)，每輪測(cè)序檢測(cè)運(yùn)行時(shí)間為65min，引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸，隨 著核酸的結(jié)合，CCD攝像機(jī)檢測(cè)到發(fā)出的光信號(hào)，CCV DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物焦磷酸測(cè)序結(jié)果如 圖 2 所示，讀取的序列為 CGGTCGTGT CGGTGTCGGT GGCTGTGTCG GCTTCCGTTT CACCG(SEQ ID No. 1)〇
[0091] 6、結(jié)果判定
[0092] 電泳結(jié)果表明GFHNV、KHV、EHNV和STIV均未擴(kuò)增出144bp的目的片段；CCV擴(kuò)增 出了 144bp目的片段，與標(biāo)準(zhǔn)一致；經(jīng)過焦磷酸測(cè)序，測(cè)定的CCV目的序列與PK基因的特異 目標(biāo)序列一致，為 CGGTCGTGT CGGTGTCGGT GGCTGTGTCG GCTTCCGTTT CACCG (SEQ ID No. 1)。 本實(shí)施例說明本發(fā)明建立的利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的方法具有良好的 特異性和準(zhǔn)確性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明提供的測(cè)序引物、目標(biāo)序列構(gòu)建用于檢測(cè) 斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的試劑盒。該試劑盒可用于對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒進(jìn)行快速檢測(cè)，具有高通量、 低成本的特點(diǎn)，產(chǎn)物可直接用于測(cè)序，不需要進(jìn)行二次處理，操作極為簡(jiǎn)便，所需樣品量小， 具有良好的應(yīng)用前景。
[0093] 顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì) 本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可 以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā) 明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一組利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的引物，其特征在于：包括如序列表 中SEQIDNo. 2和SEQIDNo. 3所示的擴(kuò)增引物對(duì)，以及如序列表中SEQIDNo. 4所示的 測(cè)序引物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一組利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的引物，其特征 在于：SEQIDNo. 3所示的引物的5'端標(biāo)記生物素。3. -種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒 包括權(quán)利要求1或2所述的一組利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的引物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括DNA提取試劑、PCR 反應(yīng)試劑、單鏈模板制備試劑和焦磷酸測(cè)序試劑。5. -種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包 括： (1) 提取待測(cè)樣品DNA作為模板； (2) 使用權(quán)利要求1或2所述的擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； (3) 若斑點(diǎn)叉尾鮰病毒特異PCR反應(yīng)為陽性，則回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，制備焦磷酸測(cè)序單 鏈模板，然后使用權(quán)利要求1所述的測(cè)序引物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，若目的序列與序列表中SEQ IDNo. 1所示的特異目標(biāo)序列一致，則待測(cè)樣品中含有斑點(diǎn)叉尾鮰病毒；若斑點(diǎn)叉尾鮰病毒 特異PCR反應(yīng)為陰性，則判定樣品為非斑點(diǎn)叉尾鮰病毒。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的引物、試劑盒和檢測(cè)方法。具體地，本發(fā)明涉及一組利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒的引物，包括如序列表中SEQ？ID？No.2和SEQ？ID？No.3所示的擴(kuò)增引物對(duì)，以及如序列表中SEQ？ID？No.4所示的測(cè)序引物。本發(fā)明還公開含有這些引物的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒進(jìn)行檢測(cè)，具有高通量、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可以精確的進(jìn)行短DNA序列分析，測(cè)序過程耗時(shí)短，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/70
【公開號(hào)】CN105400908
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511020417
【發(fā)明人】王娜, 吳紹強(qiáng), 張旻, 景宏麗, 王彩霞, 張利峰, 江育林
【申請(qǐng)人】中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院
【公開日】2016年3月16日
【申請(qǐng)日】2015年12月30日