[0029] 通過對美國國立生物信息中心NCBI基因庫（GenBank)中已公布的斑點叉尾鮰病 毒基因序列進行對比分析，根據(jù)CCV PK基因的特異性序列設計特異PCR引物對和焦磷酸測 序引物，篩選出一組最佳引物進行后續(xù)的PCR反應和測序工作。
[0030] 本發(fā)明根據(jù)斑點叉尾鮰病毒PK基因的特異區(qū)域序列設計的斑點叉尾鮰病毒特異 性引物可針對斑點叉尾鮰病毒DNA擴增出特異性單一條帶，其PCR擴增片段長度為144bp。 再根據(jù)擴增區(qū)域中包含的特異核苷酸序列（特異目標序列SEQ ID No. 1所示）設計焦磷 酸測序引物以確定斑點叉尾鮰病毒。斑點叉尾鮰病毒PK基因的目標序列：CCGGTCGTGT CGGTGTCGGT GGCTGTGTCG GCTTCCGTTT CACCG(SEQ ID No. 1)〇
[0031] 本發(fā)明經過篩選，設計得到的斑點叉尾鮰病毒特異PCR擴增引物對及測序引物分 別為：
[0032] 擴增引物對：上游引物（CCVF) :5' -GGCTTGGGCTTGATGGAC-3'（SEQ ID No. 2);
[0033] 下游引物（CCVR) :5' -Biotin-GAGGAGGACAACGCGACTG-3'（5' 端標記生物素 ）（SEQ ID No.3)；
[0034] 測序引物（CCVS) :5' -CTTGGGCTTGATGGA-3'（SEQ ID No. 4)。
[0035] 實施例2試劑盒組成
[0036] 該試劑盒包括實施例1設計的檢測斑點叉尾鮰病毒的引物組，即擴增引物對和測 序引物。該試劑盒還包括完成PCR反應和焦磷酸測序所需材料和試劑，例如DNA提取試劑 (DNeasy Blood&Tissue Kit，QIAGEN 公司）、PCR 反應試劑（PyroMark PCR Kit，QIAGEN 公 司）、單鏈模板制備試劑（鏈霉親和素包被的磁珠，GE公司），焦磷酸測序試劑（PyroMark Gold Q96 SQA Reagents、變性緩沖液、沖洗緩沖液，QIAGEN公司）等，上述材料和試劑可以 混合包裝，也可以單獨包裝，優(yōu)選地，為單獨包裝。
[0037] 實施例3檢測方法的建立
[0038] 1、斑點叉尾鮰病毒DNA的提取
[0039] 以CCV (本實驗室保存）為原料，采用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN公司，貨 號69506)提取DNA，試劑盒操作步驟為：
[0040] (1)吸取20 μ 1蛋白酶K至I. 5ml離心管的底部。（2)加入200 μ 1待提取基因組 的病毒液（病毒滴度為IO7TCIDmA). Iml)至離心管中。（3)加入200 μ I Buffer AL至樣品 中，渦旋振蕩15s混勻。（4)56°C孵育10min。（5)快速離心，去除殘留在1.5ml離心管蓋子 中的液滴。（6)加入200 μ 1 (樣品等體積）的乙醇（96-100% )，渦旋振蕩15s混勻。振蕩 完畢后，快速離心，去除殘留在1.5ml離心管蓋子中的液滴。（7)將步驟6得到的混合物轉 移至QIAamp Mini離心管柱?？凵仙w子，6000g離心lmin。（8)將QIAamp Min離心柱放入 一個新的干凈2ml接收管中，將濾液連同使用過的收集管丟棄。（9)小心打開QIAamp Mini 離心柱，加入500 μ I Buffer AWl。蓋緊蓋子，6000g離心lmin。將QIAamp Mini離心柱轉 移至一個新的2ml收集管中，將濾液連同使用過的收集管丟棄。棄濾液，小心打開QIAamp Mini離心柱，加入500 μ1 Buffer AW2。蓋緊蓋子，最大轉速離心3min。（10)將QIAamp Mini離心柱轉移到一個新的I. 5ml收集管。小心打開離心柱，加入50 μ I Buffer AE或雙 蒸水。室溫（15-25°C )孵育lmin，然后6000g離心lmin。-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0041] 2、PCR反應體系及條件
[0042] 以提取的CCV DNA為模板，用PyroMark PCR Kit (QIAGEN公司，貨號978703)進行 PCR，擴增目的片段，上下游引物為實施例1設計得到的CCVF和CCVR引物，PCR反應體系如 下：
[0043] PyroMarkPCR Master Mix：, 2χ !2.5μ! CoraILoad Conccnlralc, 10- 2.5μ1 25mΜ MgCI2 r"j·選） Ξ? 1.5mM Q:-S:'0luti.oa., .5.乂（可選） 5μ1 lOpmol/μΙ上游引物和下游引物 各1 μL DNA 模板 500ng RNasc-ircc H2O 個總休枳 25μ1
[0044] 反應程序為：95°C預變性15min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C退火30s，共循 環(huán)45次；然后72°C再延伸lOmin。
[0045] 3、瓊脂糖凝膠電泳
[0046] 將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，取0. 6g瓊脂糖，于30ml I X TAE電泳緩沖液中 加熱，充分熔化，加入GoldView? DNA染料10000倍稀釋的溶液2 μ 1，制膠，在電泳槽中加入 電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；取5 μ I PCR擴增產物分別和1 μ I 6XLoading Buffer 混合后，點樣；lOV/cm恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑迀移至凝膠中部，停止電泳，將凝膠置 于紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結果，電泳結果見圖1。
[0047] 4、制備焦磷酸測序單鏈模板
[0048] 使用20 μ 1標記有生物素的PCR產物與30 μ I CldH2O混合后再與200 μ g鏈霉親和 素包被的磁珠混合，室溫下置震蕩器上1400rpm震蕩孵育15min，用真空吸附栗將與磁珠結 合后的PCR產物吸起，然后依次通過70%乙醇5s ;變性緩沖液5s ;沖洗緩沖液5s，最后移至 預先每孔加入45 μ 1含有0. 3mol/L測序引物的結合緩沖液的PSQ96孔板上方，釋放磁珠， 將96孔板放入80°C烘箱中加熱2min后，取出冷卻至室溫。
[0049] 5、焦磷酸測序
[0050] 在焦磷酸測序儀（PYROMARK Q96)上進行反應，在20-28°C下，所采用的堿基加入 順序為15 (ATGC)，每輪測序檢測運行時間為65min，引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸，隨 著核酸的結合，CCD攝像機檢測到發(fā)出的光信號，斑點叉尾鮰病毒特異焦磷酸測序結果見圖 2,讀取的序列為 CGGTCGTGT CGGTGTCGGT GGCTGTGTCG GCTTCCGTTT CACCG(SEQ ID No.l)。
[0051] 6、結果判定
[0052] PCR產物的電泳結果表明擴增出了 144bp目的片段，與標準一致；經過焦磷酸 測序，測定的目的序列與斑點叉尾鮰病毒PK基因的特異目標序列一致，為CGGTCGTGT CGGTGTCGGT GGCTGTGTCG GCTTCCGTTT CACCG (SEQ ID No. 1)，因此可判定為斑點叉尾鮰病 毒。
[0053] 實施例4利用焦磷酸測序技術檢測樣品
[0054] 取1份斑點叉尾鮰病毒感染的鮰魚組織樣品和1份正常鮰魚組織樣品，采用實施 例3的方法對樣品進行檢測。
[0055] 1、斑點叉尾鮰組織樣品DNA的提取
[0056] 采用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN公司，貨號69506)提取斑點叉尾鮰組織 樣品基因組DNA，-20 °C冰箱保存?zhèn)溆?。參見實施?步驟1。
[0057] 2、PCR反應體系及條件
[0058] PCR反應體系及條件參見實施例3的相應步驟。以提取的斑點叉尾鮰組織樣品DNA 為模板，用PyroMark PCR Kit (QIAGEN公司，貨號978703)進行PCR，擴增目的片段。
[0059] 3、瓊脂糖凝膠電泳
[0060] 電泳方法參見實施例3的步驟3。本實施例的電泳結果見圖3。
[0061] 4、制備焦磷酸測序單鏈模板
[0062] 方法參見實施例3的步驟4。
[0063] 5、焦磷酸測序
[0064] 在焦磷酸測序儀（PYROMARK Q96)上進行反應，在20-28°C下，所采用的堿基加入 順序為15 (ATGC