一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋 白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor relatedapoptosis-;[11(111(^1^1丨8311(1，11^1]^)也稱為凋亡素-2配體(4口〇-2]^)，是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子(^即） 基因超家族成員，屬于II型跨膜蛋白（transmembrane protein) JRAIL是一個(gè)由281個(gè)氨基 酸構(gòu)成的Π 型跨膜蛋白，其中從第114個(gè)精氨酸(arginine)到第281個(gè)甘氨酸(glysine)的 序列為誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的主要功能區(qū)域。它能通過(guò)與死亡受體結(jié)合選擇性誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì) 胞與轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生凋亡，而對(duì)正常組織和細(xì)胞幾乎沒(méi)有不良反應(yīng)。這一特性使得TRAIL在腫 瘤的靶向治療中具有良好的應(yīng)用前景，被認(rèn)為是一種非常具有發(fā)展?jié)摿Φ目鼓[瘤因子，近 年已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。但單體結(jié)構(gòu)的TRAIL不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，把TRAIL應(yīng)用到臨床 上仍有許多問(wèn)題亟待解決。為了實(shí)現(xiàn)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的目的，現(xiàn)有技術(shù)中通過(guò)重組 TRAIL形成二聚體或多聚體后與死亡受體(DR4，DR5)相結(jié)合發(fā)揮細(xì)胞凋亡的作用，但現(xiàn)有技 術(shù)中針對(duì)重組TRAIL蛋白具有生物活性低、產(chǎn)量低、性質(zhì)不穩(wěn)定且易變性的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋 白及其應(yīng)用，利用PET表達(dá)載體對(duì)人類TRAIL基因（114-281序列）進(jìn)行基因克隆制作出具有 N-末端組氨酸標(biāo)簽(Histidine tag)和異亮氨酸拉鏈基序(Leucine zipper)的TRAIL重組 基因本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白及 其應(yīng)用，利用PET表達(dá)載體對(duì)人類TRAIL基因（114-281序列）進(jìn)行基因克隆制作出具有N-末 端組氨酸標(biāo)簽(Histidine tag)和異亮氨酸拉鏈基序(Leucine zipper)的TRAIL重組基因 (PET23dw-His-ILZ-hTRAIL114-281，簡(jiǎn)稱HZ-TRAIL)。本發(fā)明的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡 誘導(dǎo)配體蛋白對(duì)抗腫瘤和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有高藥效的優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 為了達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明的技術(shù)方案包括：
[0005] -種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白，由TRAIL的114-281氨基酸序列與 載體PET進(jìn)行基因克隆，制備出具有N-末端組氨酸標(biāo)簽和異亮氨酸拉鏈基序重組基因 PET23dw-His-ILZ-hTRAILl 14-281 的TRAIL重組蛋白，簡(jiǎn)稱HZ-TRAIL。
[0006] 所述的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所 不。
[0007] 所述的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白適用于在大腸桿菌、酵母和哺乳 動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。
[0008] 所述的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白可誘導(dǎo)癌細(xì)胞或炎性淋巴細(xì)胞 凋亡。
[0009] 所述的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白可應(yīng)用于抗腫瘤藥物中。
[0010] 所述的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白可應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物 中。
[0011] 本發(fā)明的有益效果包括：
[0012] 1、本發(fā)明一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白及其應(yīng)用，改善了TRAIL 固有的諸多問(wèn)題比如減少藥物降解及損失，從而延長(zhǎng)了 TRAIL的半衰期、通過(guò)延緩蛋白的排 泄，提高其抗酶解的能力，增加其溶解性與穩(wěn)定性，以及降低其免疫原性，顯著延長(zhǎng)了TRAIL 的體內(nèi)生物活性。另外，通過(guò)進(jìn)一步研究證明了 HZ-TRAIL在抗腫瘤和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥 效。
[0013] 2、本發(fā)明一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白HZ-TRAIL可以誘導(dǎo)多種 癌細(xì)胞的凋亡，而對(duì)正常組織和細(xì)胞無(wú)任何副作用。
[0014] 3、本發(fā)明一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白HZ-TRAIL在RA發(fā)病過(guò)程 中通過(guò)誘導(dǎo)炎性淋巴細(xì)胞的凋亡，降低炎癥反應(yīng)，對(duì)關(guān)節(jié)起保護(hù)作用。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1所示為本發(fā)明一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的制備方法的模式 圖。
[0016] 圖2所示為本發(fā)明野生型TRAIL和實(shí)施例2制備出的HZ-TRAIL的SDS-PAGE比較圖。 [00Π ]圖3所示為本發(fā)明制備出的HZ-TRAIL對(duì)大腸癌細(xì)胞(HCT116)殺傷能力圖。
[0018] 圖4A所示為本發(fā)明HZ-TRAIL對(duì)子宮癌細(xì)胞(HeLa)凋亡和細(xì)胞壞死比例柱狀圖；
[0019]圖4B所示為本發(fā)明HZ-TRAIL對(duì)子宮癌細(xì)胞(HeLa)形態(tài)及顏色變化圖。
[0020]圖5所示為本發(fā)明實(shí)施例7建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型和處理藥物流程圖。
[0021 ]圖6A所示為本發(fā)明實(shí)施例7HZ-TRAIL對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模式小鼠（CIA)治療的濃度 依賴性發(fā)病率變化圖；
[0022]圖6B所示為本發(fā)明實(shí)施例7HZ-TRAIL對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模式小鼠（CIA)治療的濃度 依賴性關(guān)節(jié)炎臨床指數(shù)的變化圖。
[0023]圖7A所示為本發(fā)明實(shí)施例7野生型小鼠（對(duì)照組)關(guān)節(jié)組織病理圖；
[0024]圖7B所示為本發(fā)明實(shí)施例7處理PBS后小鼠（陽(yáng)性對(duì)照組)關(guān)節(jié)組織病理圖；
[0025] 圖7C所示為本發(fā)明實(shí)施例7處理30yg/mouse的HZ-TRAIL后小鼠關(guān)節(jié)組織病理圖；
[0026] 圖7D所示為本發(fā)明實(shí)施例7處理150yg/mouse的HZ-TRAIL后小鼠關(guān)節(jié)組織病理圖；
[0027] 圖7E所示為本發(fā)明實(shí)施例7處理300yg/mouse的HZ-TRAIL后小鼠關(guān)節(jié)組織病理圖。
[0028]圖8A所示為本發(fā)明實(shí)施例7處理不同濃度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介質(zhì)TNF-a 水平的變化圖；
[0029]圖8B所示為本發(fā)明實(shí)施例7處理不同濃度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介質(zhì)IL-Ιβ 水平的變化圖；
[0030]圖8C所示為本發(fā)明實(shí)施例7處理不同濃度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介質(zhì)IFN- γ 水平的變化圖；
[0031 ]圖8D所示為本發(fā)明實(shí)施例7處理不同濃度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介質(zhì)IL-2水 平的變化圖。
[0032]圖9A所示為本發(fā)明實(shí)施例7處理不同濃度HZ-TRAIL后小鼠血清中免疫球蛋白IgGl 的水平的變化圖；
[0033]圖9B所示為本發(fā)明實(shí)施例7處理不同濃度HZ-TRAIL后小鼠血清中免疫球蛋白 IgG2a的水平的變化圖。
[0034]圖10A所示為本發(fā)明實(shí)施例8HZ-TRAIL抑制炎性淋巴細(xì)胞的增殖效果圖；
[0035]圖10B所示為本發(fā)明實(shí)施例8HZ-TRAIL對(duì)促炎介質(zhì)IL-2的表達(dá)水平變化圖；
[0036]圖10C所示為本發(fā)明實(shí)施例8HZ-TRAIL對(duì)促炎介質(zhì)IFN- γ的表達(dá)水平變化圖。
[0037]圖11Α所示為本發(fā)明實(shí)施例8HZ-TRAIL抑制Jurkat細(xì)胞的增殖效果圖；
[0038]圖11B所示為本發(fā)明實(shí)施例8HZ-TRAIL誘導(dǎo)炎性T淋巴細(xì)胞凋亡能力圖；
[0039]圖11C所示為本發(fā)明實(shí)施例8HZ-TRAIL對(duì)凋亡關(guān)聯(lián)caspase 3蛋白質(zhì)的水平變化 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 下文將結(jié)合具體附圖詳細(xì)描述本發(fā)明具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)注意的是，下述實(shí)施例中 描述的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是孤立的，它們可以被相互組合從而達(dá) 到更好的技術(shù)效果。
[0041] -種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白，由TRAIL的114-281氨基酸序列與 載體PET進(jìn)行基因克隆，制備出具有N-末端組氨酸標(biāo)簽和異亮氨酸拉鏈基序重組基因 PET23dw-His-ILZ-hTRAILl 14-281 的TRAIL重組蛋白，簡(jiǎn)稱HZ-TRAIL。
[0042] 所述的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白HZ-TRAIL氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0043] 所述的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白適用于在大腸桿菌、酵母和哺乳 動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。
[0044] -種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白的應(yīng)用，所述的重組腫瘤壞死因子 相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白可誘導(dǎo)癌細(xì)胞或炎性淋巴細(xì)胞凋亡。
[0045] 所述的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白可應(yīng)用于抗腫瘤藥物中。
[0046] 所述的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白可應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物 中。
[0047] 實(shí)施例1
[0048] -種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的制備方法，如圖1所示本發(fā)明一種重 組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的制備方法的模式圖，包括以下步驟：
[0049] 步驟