》關(guān)節(jié)紅不腫；《2》關(guān)節(jié)輕度紅腫；《3》關(guān)節(jié)中度紅腫；《4》關(guān)節(jié)重度紅腫伴 功能障礙。關(guān)節(jié)炎分數(shù)為每只小鼠所有病變關(guān)節(jié)分數(shù)的總和，最高分為16分。測定結(jié)果見圖 6A所示為HZ-TRAIL對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模式小鼠（CIA)治療的濃度依賴性發(fā)病率變化圖，圖6B 所示為HZ-TRAIL對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模式小鼠（CIA)治療的濃度依賴性關(guān)節(jié)炎臨床指數(shù)的變化 圖。由圖6結(jié)果可知，HZ-TRAIL對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有良好的治療效果。CIA的臨床指數(shù)也隨藥 物濃度的增加而逐漸減少。同樣其CIA發(fā)病率隨藥物濃度的增加而逐漸而減少。
[0088] (2)HZ_TRAIL在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用 [0089]實驗方法：
[0090] ①采樣:將上述藥物處理③野生型小鼠（對照組）、陽性對照組(PBS)、以及處理不 同濃度HZ-TRAIL的小鼠（初次免疫后第51天），利用乙醚麻醉脫頸處死小鼠并采樣，包括肘 關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)，外周血清，以及組織臟器等。關(guān)節(jié)除去病變關(guān)節(jié)的皮毛和多余的皮下組織、保 留跖趾關(guān)節(jié)，并用4%多聚甲醛固定，10%EDTA脫鈣，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片。
[0091] ②檢測分析:a)利用組織病理學(xué)方法(H/E staining)比較分析各組之間肘關(guān)節(jié)和 膝關(guān)節(jié)的炎癥程度(滑膜細胞與炎性淋巴細胞浸潤hb)利用EILSA方法和免疫染色方法比 較分析各組之間外周血清中免疫球蛋白（IgGl和IgG2a)以及關(guān)節(jié)腔中的炎性介子(TNF-a， 11^-10，11^-2，1?~-丫）的水平。測定結(jié)果見圖7對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型(〇14)處理不同濃度 HZ-TRAIL后關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化圖，其中圖7A為野生型小鼠（對照組)關(guān)節(jié)組織病理圖，圖 7B為處理roS后（陽性對照組)小鼠關(guān)節(jié)組織病理圖，圖7C、7D、7E為處理不同濃度HZ-TRAIL 后小鼠關(guān)節(jié)組織病理圖，分別為30yg/mouse、150以8/111〇1186、30(^8/111〇1186三種濃度的!12-TRAIL
[0092] 處理小鼠的關(guān)節(jié)組織病理圖。由圖7結(jié)果可知，HZ-TRAIL在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程 中對炎癥具有良好的抑制效果，炎性淋巴細胞和滑膜細胞的浸潤程度隨藥物濃度的增加而 逐漸降低。
[0093]圖8為對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型(CIA)處理不同濃度HZ-TRAIL后，血清中促炎介質(zhì) 水平的變化圖。圖8A所示處理不同濃度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介質(zhì)TNF-a水平的變化 圖、圖8B所示處理不同濃度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介質(zhì)IL-Ιβ水平的變化圖、圖8C所示 處理不同濃度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介質(zhì)IFN- γ水平的變化圖和圖8D所示處理不同 濃度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介質(zhì)IL-2水平的變化圖，可知HZ-TRAIL在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā) 病過程中對炎癥具有良好的抑制效果，血清中促炎介質(zhì)（TNF-a，IL-Ιβ，IFN- γ，IL-2)的水 平隨藥物濃度的增加而逐漸降低。
[0094] 如圖9為對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型(CIA)處理不同濃度HZ-TRAIL后，小鼠血清中免 疫球蛋白（IgGl和IgG2a)的表達水平的變化圖。由圖9A所示不同濃度HZ-TRAIL對免疫球蛋 白IgGl的表達水平的變化圖和圖9B所示不同濃度HZ-TRAIL對免疫球蛋白IgG2a的表達水平 的變化圖可知，HZ-TRAIL在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中對炎癥具有良好的抑制效果。血清中 免疫球蛋白（IgG 1和IgG2a)的表達水平隨藥物濃度的增加而逐漸降低。
[0095] 實施例7
[0096] HZ-TRAIL對炎性淋巴細胞的凋亡作用
[0097] 實驗方法：
[0098] ①脾臟細胞的分離、培養(yǎng):無菌獲取RA小鼠脾臟，用無菌PBS沖洗2-3遍，反復(fù)剪切 成細小組織塊，置于無菌培養(yǎng)皿中，加入0.1%的胰酶，在37°〇消化15!^11，離心，去除雜質(zhì)， 加入含10%胎牛血清(含1 %青霉素、鏈霉素）的DMEM，分裝于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于C02培養(yǎng)箱(37 °C)內(nèi)培養(yǎng)。
[0099] ②檢測分析:利用MTT assay、Western blot、ELISA等方法檢測并分析細胞凋亡現(xiàn) 象及相關(guān)因子(IFN-γ，IL-2，caspase-3，PARP等）的表達水平。檢測HZ-TRAIL對不同免疫細 胞的調(diào)控作用。
[0100] 如圖10A所示為HZ-TRAIL抑制炎性淋巴細胞的增殖效果圖、圖10B所示為HZ-TRAIL 對促炎介質(zhì)IL-2的表達水平變化圖、圖10C所示為HZ-TRAIL對促炎介質(zhì)IFN-γ的表達水平 變化圖，如圖l〇A、10B、10C可知，利用不同種類的藥物激活原代脾臟細胞后處理HZ-TRAIL可 以有效抑制炎性淋巴細胞的增值。細胞上清液中促炎介質(zhì)（IL-2和IFN-γ )水平的減少表明 HZ-TRAIL對炎性Τ淋巴細胞的增值具有良好的抑制作用。如圖11Α所示為HZ-TRAIL抑制 Jurkat細胞的增殖效果圖；如圖11B所示為HZ-TRAIL誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡能力圖；如圖11C 所示為HZ-TRAIL對凋亡關(guān)聯(lián)caspase 3蛋白質(zhì)的水平變化圖?？芍?，利用不同種類的藥物激 活Jurkat細胞后，HZ-TRAIL通過caspase-3的激活誘導(dǎo)Jurkat細胞的凋亡，表明HZ-TRAIL在 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中通過誘導(dǎo)炎性T淋巴細胞的凋亡抑制炎癥，改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 的癥狀。
[0101] 由上述內(nèi)容可知，本發(fā)明的一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白及其應(yīng) 用，利用PET表達載體對人類TRAIL基因（114-281序列）進行基因克隆制作出具有N-末端組 氨酸標簽(Histidine tag)和異亮氨酸拉鏈基序（Leucine zipper)的TRAIL重組基因 (PET23dw-His-ILZ-hTRAIL( 114-281)，簡稱HZ-TRAIL)。本發(fā)明的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋 亡誘導(dǎo)配體蛋白可以誘導(dǎo)多種癌細胞的凋亡，而對正常組織和細胞無任何副作用。在RA發(fā) 病過程中通過誘導(dǎo)炎性淋巴細胞的凋亡，降低炎癥反應(yīng)，對關(guān)節(jié)起保護作用。
[0102] 上述詳細說明是針對發(fā)明的可行實施例的具體說明，該實施例并非用以限制本發(fā) 明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明的等效實施或變更，均應(yīng)當包含于本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。
[0103] 另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可在本發(fā)明權(quán)利要求公開的范圍和精神內(nèi)做其它形式和 細節(jié)上的各種修改、添加和替換。當然，這些依據(jù)本發(fā)明精神所做的各種修改、添加和替換 等變化，都應(yīng)包含在本發(fā)明所要求保護的范圍之內(nèi)。
[0104]
【主權(quán)項】
1. 一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白，其特征在于，所述一種重組腫瘤壞 死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白由TRAILm-281氨基酸序列與載體PET進行基因克隆制備出具 有N-末端組氨酸標簽和異亮氨酸拉鏈基序重組基因roT23dw-His-ILZ-hTRAILn4-281的 TRAIL重組蛋白，簡稱HZ-TRAIL。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白，其特征在于， 所述的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白，其特征在于， 所述的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白適用于在大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞 中表達。4. 權(quán)利要求1~3任一項所述的一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白的應(yīng)用， 其特征在于，所述的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白可誘導(dǎo)癌細胞或炎性淋巴細 胞凋亡。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白的應(yīng)用，其特 征在于，所述的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白可應(yīng)用于抗腫瘤藥物中。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白的應(yīng)用，其特 征在于，所述的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白可應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物 中。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白及其應(yīng)用，所述一種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白由TRAIL的114-281氨基酸序列與載體PET進行基因克隆制備出具有N-末端組氨酸標簽和異亮氨酸拉鏈基序重組基因PET23dw-His-ILZ-hTRAIL114-281的TRAIL重組蛋白，簡稱HZ-TRAIL，本發(fā)明的重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白可以誘導(dǎo)多種癌細胞的凋亡，而對正常組織和細胞無任何副作用。在RA發(fā)病過程中通過誘導(dǎo)炎性淋巴細胞的凋亡，降低炎癥反應(yīng)，對關(guān)節(jié)起保護作用。對抗腫瘤和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有高藥效的優(yōu)點。
【IPC分類】A61P29/00, A61P19/02, C07K14/47, A61P35/00, A61K38/17
【公開號】CN105440120
【申請?zhí)枴緾N201510875152
【發(fā)明人】金成浩, 臧延青, 羅英花, 金美華, 孫虎男, 劉暢
【申請人】黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年12月2日