一 :HZ-TRAIL的制備:利用PET表達載體對人類TRAIL蛋白中114-281基因序列 進行基因克隆，制備出具有N-末端組氨酸標簽和異亮氨酸拉鏈基序重組基因 PET23dw-His-ILZ-h TRAILm-281的TRAIL重組蛋白，簡稱HZ-TRAIL，如圖2所示HZ-TRAIL的制備模式圖；
[0050]步驟二:HZ-TRAIL的提取和純化:將步驟一制備出的HZ-TRAIL轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中， 并在含有l(wèi)mmol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的LB培養(yǎng)液在25°C，擴繁9個小時，然后將HZ-TRAIL在大腸桿菌中重組表達，大腸桿菌細胞通過聲波降解法裂解，并離心處理后，取20ml 上清液緩慢注入到鎳-氮三乙酸螯合瓊脂糖柱中，離心處理條件為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為12000rpm， 溫度為4°C，離心處理20min，使HZ-TRAIL中的組氨酸和金屬鎳離子充分吸附，利用鎳-親和 色譜法進行逐步洗脫提取HZ-TRAIL，再經(jīng)凝膠過濾層析法進行純化，保存在-20°C。
[0051 ] 實施例2
[0052] -種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體的制備方法，本發(fā)明一種重組腫瘤壞死 因子相關(guān)凋亡誘導配體的制備方法的模式圖，包括以下步驟：
[0053] 步驟一:HZ-TRAIL的制備：利用PET表達載體對人類TRAIL蛋白中114-28基因序列 進行基因克隆，制備出具有N-末端組氨酸標簽和異亮氨酸拉鏈基序重組基因 PET23dw-His-ILZ-hTRAIL114-281的TRAIL重組蛋白，簡稱HZ-TRAIL，如圖1所示HZ-TRAIL的制備模式圖；
[0054] 步驟二:HZ-TRAIL的提取和純化:將步驟一制備出的HZ-TRAIL轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中， 并在含有l(wèi)mmol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的LB培養(yǎng)液在28°C，擴繁8個小時，然后將HZ-TRAIL在大腸桿菌中重組表達，大腸桿菌細胞通過聲波降解法裂解，并離心處理后，取20ml 上清液緩慢注入到鎳-氮三乙酸螯合瓊脂糖柱中，離心處理條件為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為12000rpm，溫 度為4°C，離心處理20min，使HZ-TRAIL中的組氨酸和金屬鎳離子充分吸附，利用鎳-親和色 譜法進行逐步洗脫提取HZ-TRAIL，再經(jīng)凝膠過濾層析法進行純化，保存在-20°C。
[0055] 實施例3
[0056] -種重組腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體的制備方法，本發(fā)明一種重組腫瘤壞死 因子相關(guān)凋亡誘導配體的制備方法的模式圖，包括以下步驟：
[0057] 步驟一 :HZ-TRAIL的制備:利用PET表達載體對人類TRAIL蛋白中114-281基因序列 進行基因克隆，制備出具有N-末端組氨酸標簽和異亮氨酸拉鏈基序重組基因 PET23dw-His-ILZ-hTRAIL114-281的TRAIL重組蛋白，簡稱HZ-TRAIL，如圖1所示HZ-TRAIL的制備模式圖； [0058]步驟二:HZ-TRAIL的提取和純化:將步驟一制備出的HZ-TRAIL轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中， 并在含有l(wèi)mmol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的LB培養(yǎng)液在30°C，擴繁6個小時，然后將HZ-TRAIL在大腸桿菌中重組表達，大腸桿菌細胞通過聲波降解法裂解，并離心處理后，取20ml 上清液緩慢注入到鎳-氮三乙酸螯合瓊脂糖柱中，離心處理條件為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為12000rpm，溫 度為4°C，離心處理20min，使HZ-TRAIL中的組氨酸和、金屬鎳離子充分吸附，利用鎳-親和 色譜法進行逐步洗脫提取HZ-TRAIL，再經(jīng)凝膠過濾層析法進行純化，保存在-20°C。
[0059] 實施例4
[0060] 取實施例2制備出的HZ-TRAIL同野生型TRAIL的SDS-PAGE比較，結(jié)果見圖2。由圖2 所示的A野生型TRAIL和B實施例2制備出的HZ-TRAIL的SDS-PAGE比較圖可知，HZ-TRAIL分子 量比野生型TRAIL增加了約5kDa，出現(xiàn)在25kDa位置。
[0061] 實施例5
[0062] HZ-TRAIL的抗腫瘤活性測定
[0063] (l)HZ-TRAIL對癌細胞的殺傷作用
[0064] (2)實驗方法：(MTT實驗）
[0065]①接種細胞:用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔10000個細 胞接種到96孔板，每孔體積為200μ1。
[0066]②培養(yǎng)細胞:5 % C02，37°C孵育24h，至細胞單層鋪滿孔底。
[0067]③血清饑餓:加藥2h以前換培養(yǎng)液(含1 %FBS的培養(yǎng)液）。
[0068] ④藥物處理：將實施例2制備出的HZ-TRAIL分別取終濃度為0，1，3，10，30，100， 300，1000ng/ml 處理 CCD-986sk 細胞和 HCT116 細胞 24h。
[0069] ⑤呈色反應:每孔加 MTT溶液(5mg/ml，用PBS配制，pH 7.4)20μ1。繼續(xù)孵育2-4h后， 小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，小心用roS洗滌2次，然后每孔加 100μΙ二甲基亞砜(DMS0)，震蕩 1 〇分鐘，使結(jié)晶充分溶解。
[0070]⑥比色:選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時 間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。測定結(jié)果見圖3所示HZ-TRAIL對大腸癌細 胞(HCT116)殺傷能力。結(jié)果分析：
[0071]在圖3中可以看出HZ-TRAIL對結(jié)腸癌細胞(HCT116)具有良好的殺傷能力，其殺傷 強度隨藥物濃度的增加而逐漸升高，呈劑量依賴性。但是HZ-TRAIL對正常人皮膚成纖維細 胞(CCD-986sk)沒有任何副作用。
[0072] (2)HZ_TRAIL對癌細胞的凋亡作用
[0073] 實驗方法：（體外實驗-Annexin-v染色法）
[0074]①接種細胞:用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔10000個細 胞接種到12孔板，每孔體積為lml。
[0075]②培養(yǎng)細胞:5 % C02，37°C孵育24h，至細胞單層鋪滿孔底。
[0076] ③藥物處理:加入實施例2制備出的終濃度為100ng/ml的HZ-TRAIL，處理不同時間 (0,3,6，12,24h)〇
[0077] ④用PBS洗滌2次，加入 195μ1 Annexin V-FITC結(jié)合液，再加入5μ1 Annexin V-FITC輕輕混勻。
[0078] ⑤加入10μ1碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色液，輕輕混勾。
[0079] ⑥室溫（20-25°C)避光孵育15分鐘。
[0080]⑦在熒光顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)及顏色的改變，綠色熒光為Annexin ν-FITC染 色陽性細胞，紅色熒光為碘化丙啶陽性細胞。僅被綠色熒光染色，且體積較小的細胞為凋亡 細胞;被紅色或綠色和紅色雙染，且體積較大的細胞為壞死細胞;未被染色的細胞為正常細 胞。隨機觀察200個細胞，求得各種細胞所占的百分比，每個樣本計數(shù)3次取平均。測定結(jié)果 見圖4所示HZ-TRAIL對子宮癌細胞(HeLa)的凋亡能力測定圖。圖4A為細胞凋亡和細胞壞死 比例柱狀圖，黑色為細胞凋亡，白色為細胞壞死；圖4B為細胞形態(tài)及顏色改變。由圖4所示的 實施例5HZ-TRAIL對子宮癌細胞(HeLa)的凋亡能力測定圖可知實施例結(jié)果分析HZ-TRAIL (300ng/ml)可以誘導子宮癌細胞(HeLa)的凋亡，其癌細胞凋亡能力隨著時間的增加而逐漸 升尚。
[0081 ] 實施例6
[0082] HZ-TRAIL對類風濕關(guān)節(jié)炎的治療效果測定
[0083] (l)HZ-TRAIL在類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中對臨床指數(shù)的影響 [0084]實驗方法：（類風濕關(guān)節(jié)炎動物模型）
[0085]①實驗動物:DBA/1J小鼠，雄性，7-8周齡，體重20±0.34g，飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)動 物室。
[0086]②CIA小鼠模型建立:a)將II型膠原(CII)溶于0.05mol/L的冰醋酸中，濃度為2mg/ ml，將溶解的膠原與CFA等體積混合，冰浴中使用勻漿器充分乳化。b)免疫動物時，在小鼠尾 根部多點皮內(nèi)注射0.1ml乳劑(含100mg CII和200mg結(jié)核分枝桿菌）。基礎(chǔ)免疫后第21天以 同樣方法重復，避開初次免疫部位，進行加強免疫。③藥物處理:a)分為5個實驗組，即野生 型小鼠（對照組）10只，陽性對照組(？85)10只，以及處理不同濃度取11^11^的小鼠（3(^8/ mouse，150yg/mouse，300yg/mouse)各10只，總共50只。b)對于處理不同濃度HZ-TRAIL的小 鼠，加強免疫后第21天開始每3天或每1周處理1次（?.ρ，50μ1)藥物，直到實驗結(jié)束(初次免 疫后第51天)為止。如圖5所示建立類風濕關(guān)節(jié)炎動物模型和處理藥物流程。
[0087] ④檢測分析:通過觀察關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)外病變及利用關(guān)節(jié)炎評分方法，比較分析各組 之間RA的各種指標包括關(guān)節(jié)炎臨床指數(shù)(Clinical score)，發(fā)病率(Incidence)等。評分方 法:《0》無紅腫；《1