[0048] 5 Plate read
[0049] 6 82〇C 30sec
[0050] 7 Plate read
[0051] 8 Go to step 2for more 39times
[0052] 9 Perform melting curve from 55.0〇Cto 95.0〇C,read every 0.2°C,hold for lsec
[0053] 反應結(jié)束后確認實時熒光定量PCR的擴增曲線和熔解曲線，各基因的表達強度根 據(jù)CT值(threshold cycle values)、內(nèi)參基因(GAPDH)標化后，采用group t-test檢驗計算 P值。
[0054] 2.結(jié)果
[0055] L0C284454在正常對照組織中不表達或者表達很低，而在鼻咽癌組織中高表達P〈 0.001(圖 1)
[0056] 實施例2,實時熒光定量PCR法檢測證實L0C284454在鼻咽癌患者血清中表達上調(diào)
[0057] 1.材料與方法：
[0058] 使用BD 10ml血漿采集管(EDTA抗凝管)采集收集14例正常人和77例鼻咽癌患者靜 脈空腹血約8ml，輕輕顛倒3次，lh內(nèi)離心，X 160(^，1〇111；[11，4°0;冰上小心吸取上層血衆(zhòng)至新 的離心管，編號、標記，_80°C保存。
[0059] 血衆(zhòng)中抽提總RNA利用血衆(zhòng)核酸抽提試劑盒QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Catalog no.55114，Qiagen公司）抽提，具體步驟如下：
[0060] (1)吸取300ul蛋白酶K至50ml離心管。
[0061] (2)加3ml血漿至離心管。
[0062] (3)加 2.4ml carrier-ACL mix至離心管，蓋好管帽，禍旋振蕩30s混勾。
[0063] (4)將離心管放到水浴箱中60°C孵育30min。
[0064] (5)從水浴箱中取出離心管，旋開管蓋。加入5.4ml ACB緩沖液至離心管，關閉管 蓋，渦旋震蕩20s，充分混勻。
[0065] (6)將離心管置于冰上孵育lOmin。由于熒光實時定量PCR需要參照，血清循環(huán)RNA 檢測過程中無公認可靠的內(nèi)參基因（管家基因），因此我們選擇往3ml血漿中加入lng無關質(zhì) 粒pGL3 (購自Promega公司）作對照。
[0066] (7)采用真空抽吸方法純化血清核酸(包括血清中的RNA及加入的pGL3質(zhì)粒DNA): 組裝好20ml延長管，mini柱和真空連接器，打開真空栗，待到全部裂解液通過mini柱(約10 分鐘），關閉真空栗，將壓力釋放到〇,卸下并丟棄延長管。
[0067] (8)加600ul ACW1緩沖液到mini柱，維持mini柱蓋子呈打開狀態(tài)，打開真空栗，待 到ACW1完全通過mini柱，關閉真空栗，將壓力釋放到0。（第一遍洗滌，去除雜質(zhì)，純化mini膜 上的核酸）
[0068] (9)加750ul ACW2緩沖液到mini柱，維持mini柱蓋子呈打開狀態(tài)，打開真空栗，待 到ACW2完全通過mini柱，關閉真空栗，將壓力釋放到0。（第二遍洗滌，去除雜質(zhì)，純化mini膜 上的核酸）
[0069] (10)加750ul 100%乙醇至mini柱，維持mini柱蓋子呈打開狀態(tài)，打開真空栗，待 到乙醇完全通過mini柱，關閉真空栗，將壓力釋放到0。（第三遍洗滌，去除雜質(zhì)，純化mini膜 上的核酸）
[0070] (11)關閉mini柱的蓋子，將mini柱卸下來，丟棄連接器，將mini柱放到干凈的2ml 收集管，20，000x g離心3min。（去除殘留的乙醇）
[0071] (12)將mini柱放到一個新的2ml收集管，打開管蓋，放到水浴箱中56°C孵育10min， 直到mini膜完全干燥。將mini柱放到一個干凈的1.5ml洗脫管，丟棄上一步的2ml收集管，加 入20ul AVE緩沖液(不含carrier RNA)至mini膜的中央，關上蓋子，室溫孵育3min。20，000x g離心lmin，洗脫純化的核酸。
[0072] lyg RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進行實時熒光定量PCLL0C284454正向引物為5'-ATCCCCAACTCTGCAACTGG-3 ' 如SEQ N0:6所示，和反向引物5 ' -ACACAGCTGGCTTCCCTTTT-3 ' 如 SEQN0:7**。
[0073] 用于對照的質(zhì)粒pGL3正向引物為5'-TCCATCTTGCTCCAACACCC-3'如SEQN0:8所示， 和反向引物5'-TCGTCTTTCCGTGCTCCAAA-3'，如SEQ N0:9所示。
[0074] 進行反轉(zhuǎn)錄得cDNA，取cDNA為模板，加入SEQ ID N0:6、7、8、9所示的引物以及PCR 反應液，進行PCR擴增，檢測樣本閾值Cq;同時，pGL3質(zhì)粒DNA液10倍梯度稀釋，作為校對樣 本，在每個PCR反應板中進行檢測，記錄Cq值；內(nèi)參pGL3質(zhì)粒PCR擴增;實時熒光定量PCR反應 體系 iTaqIY, Universal SYBRK Green Super Mix 5 μΙ PCR Forward Primer ( ΙΟμηι) 0.5μL PCR Reverse Primer (ΙΟμηι) (),5μ1
[0075] eDNA 模板 2.0μ1 dH20 2 μL Total 10 μΙ
[0076] 實時熒光定量PCR反應步驟
[0077] 1 95〇C 30sec
[0078] 2 95〇C 5sec
[0079] 3 60°C 30sec
[0080] 4 Go to step 2for more 35times
[0081] 5 Perform melting curve from 55.0〇Cto 95.0〇C?read every 0.2°C?hold for lsec
[0082] 制作標準曲線:上述檢測完成后，拷貝數(shù)以10為底取對數(shù)作為橫坐標，Cq值為縱坐 標作圖，繪制標準曲線，計算斜率S，然后根據(jù)公式E = 10(_1/s)-l，計算擴增效率E;
[0083] 計算:選中樣本和校對樣本檢測孔，應用實時熒光定量PCR儀的隨機軟件得出樣本 閾值Cq(T)和校對樣本閾值Cq(C)，根據(jù)公式Q=(E+lΓ Λeq，ΛCq=[Cq(T)-Cq(C)]，得出基因 的校正起始拷貝數(shù)Q;將L0C284454的Q值與pGL3質(zhì)粒的Q值的幾何平均數(shù)相比，得到 L0C284454的相對表達量，采用unpaired t-test檢驗計算P值。
[0084] 2.結(jié)果
[0085] L0C284454在正常人血清中不表達或者表達很低，而在鼻咽癌患者血清中高表達P 〈0.001(圖2)。
[0086]實施例3,原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)L0C284454在鼻咽癌中的表達與患者預后相關
[0087] 1.材料方法
[0088] 1.1設計并合成雜交探針
[0089]為了采用原位雜交方法檢測L0C284454的表達情況，我們設計了針對原位雜交檢 測L0C284454表達的寡核苷酸探針及陽性對照兩組原位雜交寡核苷酸探針各3條。
[0090]用于原位雜交檢測L0C284454表達的寡核苷酸探針：
[0091 ] L0C284454探針1:5 ' -GACCGGAAAATAACAAACAAAAACTCTGCCTCAG-3 ' 如SEQ N0:10所 示，
[0092] L0C284454探針2:5 ' -GTGATAGAACTTTAGTCTACCCTCCTCCGAAAAA-3 ' 如SEQ NO: 11所 示，
[0093] L0C284454探針3:5'-GTACAGACAACAAGTTCATTTATTTTCAACGGGAC-3'如SEQ N0:12所 不。
[0094] 陽性對照探針(檢測看家基因 GAPDH):
[0095] GAPDH探針1:5，-CCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAGCCCTGG-3，，如SEQ N0:13所示，
[0096] GAPDH探針2:5，-CAGTAGAGGCAGGGATGATGTTCTGGAGAG-3，，如SEQ N0:14所示，
[0097] GAPDH探針3:5，-GTCAGAGGAGACCACCTGGTGCTCAGTGTA-3，，如SEQN0:15所示。
[0098] 采用化學合成方法合成上述設計的各基因特異性寡核苷酸探針序列。
[0099] 1.2寡核苷酸探針標記試劑盒和原位雜交檢測試劑
[0100] 地高辛寡核苷酸加尾試劑(Dig Oligonucleitide Tailing Kit 2nd Generation， Roche公司），抗地高辛-辣根過氧化物酶復合物檢測試劑盒(Anti-Digoxigenin-P0D，F(xiàn)ab fragments，Roche公司），增強原位表達檢測信號的TSA信號放大系統(tǒng)（TSA? Biotin System，NEL700試劑盒，PerkinElmer公司），DAB染色試劑盒(北京中山公司），20x檸檬酸鈉 緩沖溶液（saline sodium citrate，SSC)，硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)，去離子甲酰胺 (Deionized Formamide)，多聚腺苷酸（polyadenylic acid，Poly A)，多聚脫氧腺苷酸 (polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，變性剪切的娃精DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)，酵母轉(zhuǎn)運RNA(yeast t_RNA，tRNA)，二硫蘇糖醇（DTT)，50x鄧罕 氏緩沖液(Denhardts's solution)，磷酸緩沖液(PBS buffer)，胃蛋白酶K，牛血清白蛋白 (BSA)，三乙醇胺（TEA)，TNB Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5,0.15M NaCL，0.5%Blocking Reagent)，TNT Buffer(0.1M Tris-HCl，pH7.5,0.15M NaCL，0.05%Tween 20)，醋酸酐，阻 斷試劑（Blocking reagent agent，Roche公司）。
[0101] 1.3其他主要試劑和材料
[0102] 無水乙醇、90 %酒精、70 %酒精、50 %酒精、松節(jié)油、雙蒸水、PBS緩沖液(pH7.2~ 7.4，NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HP〇4 4.3mmol/L，KH2P〇4 1.4mmol/L);3% 甲醇-雙氧水溶液(80%甲醇和30%雙氧水配置）；0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(citrate buffer, CB，pH6.0±0.1，9ml 0.1M檸檬酸溶液和41ml 0.1M檸檬酸鈉溶液加入450ml蒸餾水中臨時 配置后再校正工作液pH值）；0.1 %胰蛋白酶;蘇木素；1 %鹽酸酒精（1ml濃鹽酸+99ml 70 % 酒精配置）；封片膠(PTS Cure Mountn );專用蓋玻片(480X240mm2)定制于鄭州玻璃儀器 廠。Leica低熔點（58°C)石蠟，國產(chǎn)蜂蠟，無水酒精，二甲苯，10%中性多聚甲醛(0.01m 〇l/L， pH7.4，DEPC雙蒸水和PBS緩沖液配制），蘇木素，伊紅，中性封片樹膠，蓋玻片，載玻片。
[0103] 1.4標記探針
[0104] 利用3-tailing DIG Olignucleutide Kit進行寡核苷酸探針標記，反應體系如 下。
[0105] lOOpmol oligonucleotide+ddH2〇 = 9yl(control: control oligonucleutide 5μ l+ddH20 4μ1) Reaction buffer 4μ1 Coe 12 4μ1
[0106] Dig-dUTP ΙμL dATP ΙμL Terminal transferase 1 μL
[0107] 混勻，稍離心。37°C水浴反應30min，加2μ1 EDTA(0.2M，PH 8.0)中止反應。
[0108] 1.5寡核苷酸探針標記后純化
[0109]為了增加標記探針的純度，需對已標記的探針進行純化，具體操作如下：
[0110] 1)探針反應