br>[0193] 1.3 shRNA載體構建
[0194] 化學合成上述4個shRNA對應的8條單鏈oligo序列，將合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μΜ，互補單鏈各取10μ1混合。然后將oligo混合物在PCR儀中95 °C加熱5分鐘，然后自然冷卻至室溫，形成雙鏈oligo片段。
[0195] 用Bgl II和Hind III雙酶切pSUPER質粒，回收3. lkb的載體片段，將退火后的粘性 末端的DNA和酶切回收的載體按照3:1的物質量的比例混合，用T4連接酶，16°C連接過夜。轉 化E.coil感受態(tài)，挑選轉化子，菌落PCR以及測序鑒定，再用Cla I和EcoR I酶切構建好的 pSUPER質粒，2 %的瓊脂糖DNA凝膠電泳，以空白pSUPER為空白對照，判斷插入了目的片段的 陽性克隆，陽性克隆測序驗證后用于干擾細胞內(nèi)L0C284454的表達。
[0196] 1.4細胞培養(yǎng)與轉染
[0197] 鼻咽癌細胞系5-8F、HNE2和HK1購自中南大學細胞中心，細胞培養(yǎng)所用RPMI 1640 培基和胎牛血清，及消化細胞所用的胰蛋白酶均為美國Gibco公司產(chǎn)品。
[0198] 將生長狀態(tài)良好的鼻咽癌細胞系5_8F、HNE2和HK1按2X 105個細胞/孔接種于6孔 板中，將6孔板置于37°C，5%⑶:^培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)細胞生長至50-70%密度即可開始shRNA 表達載體的轉染;轉染過程如下：
[0199] 在無菌EP管中加入3μ1的lipofectamine 3000于100μ1無血清培養(yǎng)基中混勻靜置 5min；
[0200] 將構建的shRNA表達載體加入100μ1無血清培養(yǎng)基中；然后與上述包含 lipofectamine的100μ1無血清培養(yǎng)基溫和混勾，室溫靜置30分鐘，使DNA與脂質體形成復合 體；
[0201 ]用D-Hank ' s液洗滌細胞3次；
[0202] 將上述混合物中加入800μ1無血清培養(yǎng)基(無抗生素），溫和混勻后加入6孔板中的 1個孔；
[0203] 將6孔板置于⑶2培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)6小時，然后棄上清，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培 養(yǎng)48小時。
[0204] 1.5實時定量PCR檢測shRNA干擾IncRNA表達的效果：
[0205] 將各種shRNA載體轉染后的鼻咽癌細胞抽提總RNA，2yg RNA經(jīng)逆轉錄成cDNA后，進 行實時熒光定量PCRDL0C284454 引物為5 ' -TTCCTAGCAGCCAGTTACCC-3 '，和5 ' -CTCCCGGCAAGTTAGAAAGC-3,。
[0206] 用于對照的GAPDH 引物為5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'和5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。
[0207] 實時熒光定量PCR反應體系 SYBR? Premix Ex Taq? (2χ) 10μ1 PCR Forward Primer 0-Ομπι) 0.4μ1 PCR Reverse Primer (ΙΟμηι > 0.4μ1
[0208] eDNA 投板 2.0μΙ dH20 7.2μ1 Total 20μ!
[0209] 實時熒光定量PCR反應步驟
[0210] 1 94〇C 5min
[0211] 2 95〇C lOsec
[0212] 3 58〇C 30sec
[0213] 4 72〇C 20sec
[0214] 5 Plate read
[0215] 6 82〇C 30sec
[0216] 7 Plate read
[0217] 8 Go to step 2for more 39times
[0218] 9 Perform melting curve from 55.0〇Cto 95.0〇C,read every 0.2°C,hold for lsec
[0219] 反應結束后確認實時熒光定量PCR的擴增曲線和熔解曲線，各基因的表達強度根 據(jù)CT值(threshold cycle values)、內(nèi)參基因(GAPDH)標化后，采用group t-test檢驗計算 P值。
[0220] 2.結果
[0221] 這三個shRNA載體轉染鼻咽癌細胞5_8F、HNE2和HK1后，均可顯著下調(diào)鼻咽癌細胞 中L0C284454的表達水平（圖5)。
[0222] 實施例5,制備荷載shRNA干擾載體的納米顆粒抑制鼻咽癌細胞中L0C284454的表 達
[0223] 1.材料方法
[0224] 1.1制備多聚賴氨酸包被的硅納米顆粒
[0225]多聚賴氨酸包被的硅納米顆粒是運用0P10/環(huán)己烷/氨水微乳液自組裝技術進行 娃納米顆粒(silica nanoparticle，SiNP)的合成，并利用娃納米顆粒的表面能和通過離子 靜電作用，制備多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒;所述的納米顆粒可以由以下方法制備得到：
[0226] 1)將0P-10、環(huán)己烷和氨水混合，室溫攪拌均勻后加入正硅酸異酯（TE0S)，繼續(xù)攪 拌至聚合完成，加入等體積丙酮，超聲分散，離心，雙蒸水洗滌三次，離心收集沉淀于80°C干 燥，研細得硅納米顆粒(SiNP)。其中H 20與0P-10及H20與TE0S的摩爾比為2~10、氨水濃度為 1.6~28%、TE0S在環(huán)己烷中的摩爾濃度為0.1~3mol/L。
[0227] 2)將SiNP按0.1~10mg/ml重懸于0.6M Na⑶3溶液中，超聲分散，離心，棄上清，再 將沉淀物按〇.1~1〇1^/1111重懸于?135(。!17.4)中，超聲分散，加多聚賴氨酸（終濃度為4~ 15nmol/mL)，充分混勻，室溫混搖;離心，棄上清，沉淀重懸于雙蒸水中，得到多聚賴氨酸修 飾的娃納米顆粒。多聚賴氨酸的終濃度為4~15nmo 1 /mL。
[0228] 1)將改性硅納米顆粒超聲分散，按質量比5~30 : 1與實施例3中所述的靶向 L0C284454的RNA干擾載體混合，室溫靜置使其結合。
[0229] 1.2細胞培養(yǎng)與轉染
[0230] 將生長狀態(tài)良好的鼻咽癌細胞5-8F、HNE2和HK1按2X105個細胞/孔接種于6孔板 中，將6孔板置于37°C，5 % C02培養(yǎng)箱中，待培養(yǎng)細胞生長至50-70 %密度即可開始 L0C284454真核表達載體的轉染;轉染過程如下：
[0231] 在無菌EP管中加入100μΙ制備好的攜帶L0C284454真核表達質粒的多聚賴氨酸修 飾的硅納米顆粒懸液，與1〇〇μ1無血清培養(yǎng)基溫和混勻；用D-Hank ' s液洗滌細胞3次;將上述 混合物中加入800μ1無血清培養(yǎng)基(無抗生素），溫和混勻后加入6孔板中的1個孔;將6孔板 置于C0 2培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)6小時，然后棄上清，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)過夜。用攜帶 Scramb 1 e序列的多聚賴氨酸修飾的娃納米顆粒作為實驗對照。
[0232] 1.3細胞穿膜實驗
[0233] 細胞穿膜（（Transwell)實驗是驗證腫瘤細胞侵襲能力的實驗方法。Transwell小 室（孔徑8μπι)及基質膠（Matrigel)購自美國BD公司，4%多聚甲醛固定液、結晶紫染液 (0· 1 %g/ml)購自Sigma公司。將Matrigel按1:8稀釋，包被在Transwell小室底部膜的上室 面，置37°C30分鐘使Matrigel聚合成凝膠。使用前按BD公司說明書進行基質膠膜水化。
[0234] 在每個Transwell小室上層加入無血清培養(yǎng)基和1 X 105個轉染了 L0C284454 shRNA干擾載體或對照載體(Scramble)的鼻咽癌細胞，在Transwell小室下層加入含20 %胎 牛血清的培養(yǎng)基。細胞繼續(xù)培養(yǎng)36小時后，用4%多聚甲醛固定液固定，結晶紫染色，用棉簽 輕輕擦掉上層未迀移細胞，用PBS洗3遍。在顯微鏡下觀察穿過基質膠膜的鼻咽癌細胞。
[0235] 1.4細胞劃痕實驗
[0236] 細胞劃痕實驗是驗證腫瘤細胞迀移能力的實驗方法。轉染了L0C284454 shRNA干 擾載體或對照載體（Scramble)的鼻咽癌細胞接種于6孔板，待細胞密度達到90%時，用 200ul pipet在每個6孔板中劃一條直線(劃痕），隨后在0、8、12、16、24、32、48小時等各個時 間點（視不同細胞迀移能力而定)在顯微鏡下觀察劃痕愈合情況，拍照，并計算各組細胞迀 移速度。
[0237] 2.結果
[0238] 2.1在鼻咽癌細胞中導入L0C284454的干擾載體抑制L0C284454后，細胞侵襲能力 降低
[0239] 細胞穿膜（Transwell)實驗證實，在鼻咽癌細胞系5_8F、HNE2和HK1中轉入靶向 L0C284454的干擾載體，抑制L0C284454的表達后，能穿過基質膠膜的鼻咽癌細胞數(shù)目顯著 減少，表明細胞侵襲能力降低（圖6)。
[0240] 2.2在鼻咽癌細胞中導入1^^284454的干擾載體抑制1^^284454表達后，細胞迀移 能力降低
[0241 ] 細胞劃痕實驗證實，在鼻咽癌細胞系5-8F、HNE2和HK1中轉入靶向L0C284454的干 擾載體，抑制L0C284454的表達后，鼻咽癌細胞從劃痕兩邊往劃痕中央迀移的速度減慢，劃 痕愈合的時間延長，表明細胞運動迀移能力降低（圖7)。
[0242] 實施例6,裸鼠轉移瘤模型證實抑制L0C284454的表達可以抑制鼻咽癌細胞的轉移 能力
[0243] 1.材料與方法
[0244] 10只雄性BALB/C裸鼠，4周齡，重量為19 ± 2g，購買于上海斯萊克實驗動物有限公 司。所有裸鼠均質檢合格，在中南大學實驗動物部于無特定病原體（SPF)條件下飼養(yǎng)。 L0C284454干擾載體構建及多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒的制備、細胞培養(yǎng)與轉染等同實 施例4。轉染L0C284454干擾載體或Scramble載體(NC)的5-8F細胞各取1 X 106個，經(jīng)尾靜脈 注入裸鼠體內(nèi)（5只每組），10周后處死裸鼠，觀察鼻咽癌細胞的轉移情況(主要轉移到裸鼠 肺中）。
[0245] 2.結果
[0246] 動物實驗進一步證實干擾L0C284454的表達可抑制鼻咽癌細胞的轉移能力（圖8)。 與對照組(NC)相比，敲低L0C284454的5-8F細胞肺轉移灶的數(shù)目（圖8六、(：少〈0.05)變少，轉 移灶的體積變小（圖8B、D)，表明鼻咽癌細胞的轉移能力受到明顯抑制。
【主權項】
1.檢測鼻咽癌患者血清中長鏈非編碼RNA L0C284454表達量的試劑的應用，其特征在 于，所述的試劑用于制備鼻咽癌輔助診斷或者療效預測制劑;該長鏈非編碼RNA L0C284454 的序列如SEQ N0:1所示。2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的鼻咽癌輔助診斷或者療效預測制劑 為實時熒光定量檢測試劑。3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的實時熒光定量檢測試劑中包含用于 實時熒光定量檢測L0C284454表達的引物序列： 正向引物:5 ' -ATCCCCAACTCTGCAACTGG-3 '， 反向引物：5'-ACACAGCTGGCTTCCCTTTT-3'。4.根據(jù)權利要求2或3所述的應用，其特征在于，所述的實時熒光定量檢測試劑中包含 用于對照的檢測熒光素酶基因的 正向引物為5'-TCCATCTTGCTCCAACACCC-3' 反向引物5'-TCGTCTTTCCGTGCTCCAAA-3'。
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測鼻咽癌患者血清中長鏈非編碼RNA？LOC284454表達量的試劑的應用，主要是用于制備鼻咽癌輔助診斷或者療效預測的實時熒光定量檢測試劑。實時熒光定量PCR技術驗證了lncRNA？LOC284454在鼻咽癌患者血清(77例)和正常人血清(14例)中的表達情況；LOC284454在鼻咽癌患者血清中的表達比正常人血清中顯著提高。本發(fā)明為鼻咽癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療提供了重要的參考依據(jù)。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105483273
【申請?zhí)枴緾N201610066767
【發(fā)明人】曾朝陽, 李桂源, 熊煒, 李小玲, 唐艷艷, 楊麗婷, 孛昊, 李夏雨, 涂超峰, 綦鵬, 龔朝建, 張文玲
【申請人】中南大學
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2016年1月29日