混合物（22μ1)+2·5μ1 4M LiCL+75yl 100%冷乙醇（_20°C).
[0111] 2)-70。(3沉淀6011^11，〇廣20。〇211。
[0112] 3)13.000Xg 4°C離心15min。
[0113] 4)棄上清，用50μ1冰冷的70% (V/V)乙醇洗滌。
[0114] 5)13.000xg 4°C，離心5min。
[0115] 6)棄上清，真空4°C干燥。
[0116] 7)用無菌雙蒸水重溶探針。
[0117] 1.6原位雜交檢測存檔石蠟切片中L0C284454的表達(dá) [0118]石蠟切片雜交前處理
[0119] 1)4°C保存的石蠟切片置于58°C烤片30min，熔化表面石蠟。
[0120] 2)二甲苯依次脫蠟3X5min。
[0121 ] 3)梯級酒精洗滌，100 % 酒精2 X 2min-95 % 酒精 1 X 5min-70 % 酒精 1 X 5min- 50%酒精lX5min4DEPC水洗滌2X3min4DEPC-PBS洗滌2X5min。
[0122] 4)滴加300μ1胃蛋白酶K(10μg/ml)于切片上，37°C消化20min。
[0123] 5)切片入PBS(0.1M PBS+2mg/ml谷氨酸)洗滌lmin，中止反應(yīng)。
[0124] 6)切片入0.2N HCL，于37°C反應(yīng)20-30min，增加組織的通透性。
[0125] 7)切片用4%多聚甲醛(0.1M PBS溶解)后固定lOmin，室溫。
[0126] 8)為了增加組織陽性雜交強(qiáng)度，對切片進(jìn)行乙酰處理。切片入0.25 %乙酸酐 BufferI(0.1M 三乙醇胺），室溫 lOmin。
[0127] 9)1M PBS洗滌2X5min。
[0128] 預(yù)雜交和雜交
[0129] 預(yù)雜交:_20°C保存的預(yù)雜交液，先置于37°C孵育60min，預(yù)雜交液的用量為50μ1， 石蠟?zāi)ぢ纳w切片，37°C濕盒中預(yù)雜交2小時(shí)。（預(yù)雜交液成份包括：2XSSC，10%De Xtran sulphate,IX Denhardt's solution,50mM Phosphate Buffer(PH 7.0),50mM DTT,250yl, 100μg/ml poly A,5μg/ml poly dA,250μg/ml yeast t-RNA,500μg/ml ssDNA,47% Deionized formamide)〇
[0130] 1)移去石蠟?zāi)?，甩掉預(yù)雜交液，切片置于2 X SSC中5min。
[0131] 2)雜交反應(yīng)：37°C雜交過夜（18_20h)。每一切片加入250μ1雜交液并用石蠟?zāi)ぢ?蓋。預(yù)雜交液中加入相應(yīng)的探針就成為雜交液。雜交液在預(yù)雜交時(shí)配制，放置37°C孵育，使 探針充分溶解于雜交液中，本實(shí)驗(yàn)用多條寡核苷酸探針混合，按每一探針500ng/ml濃度配 制成探針雜交液。地高辛加尾標(biāo)記試劑盒標(biāo)記探針濃度計(jì)算依據(jù):每一探針的濃度按其與 陽性定量探針時(shí)檢測反應(yīng)時(shí)顯色進(jìn)行比對和lOOpmol 30個(gè)堿基的裸探針標(biāo)記反應(yīng)理論探 針產(chǎn)量為900ng兩種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合計(jì)算出標(biāo)記探針的濃度。
[0132] 3)雜交后洗滌，切片浸入2 X SSC，10min，揭去石蠟?zāi)?。依次于搖床上搖動(dòng)洗滌，2 X SSC(0.5%SDS)，2X15min-0.25XSSC(0.5%SDS)，2X15min。
[0133] 雜交后顯色檢測反應(yīng)
[0134] 1)采用Anti-Digoxigenin-POD檢測地高辛探針與mRNA結(jié)合復(fù)合物;TSA放大系統(tǒng) 增強(qiáng)原位雜交反應(yīng)顯色反應(yīng)的陽性信號，DAB顯色。
[0135] 2)切片轉(zhuǎn)至TNT緩沖液中，3X5min。
[0136] 3)滴加 TNB 阻斷緩沖液，300yl/TMAs，室溫，30min。
[0137] 4)吸去多余阻斷劑，1:100稀釋的Anti-Digoxigenin_P0D(TBS+0· 1 %Triton X-100+1 %阻斷劑），室溫4小時(shí)。
[0138] 5)TNT Buffer(0.1M Tris-CL，pH7.5,0.15M NaCL，0.05%Tween 20)洗滌， 3x5min〇
[0139] 6)切片上滴加信號放大試劑Biotinyl Tyamid，300yl/TMAs，（Biotinyl Tyramid 貝士存液:Biotinyl Tyramid溶解于0.2ml DMS0，Biotinyl Tyramid工作液：1X稀釋液，1:50 稀釋Biotinyl TyramidlC存液），室溫10分鐘。
[0140] 7)了町洗，3\511^11。
[0141] 8)切片滴加 SA-HRP(鏈霉卵白素-辣根過氧化物酶），300yl/TMAs，室溫30min。
[0142] 9)丁町洗，3\511^11。
[0143] 10)蒸溜水洗滌，lXlmin。
[0144] 11)DAB顯色，顯微鏡下控制顯色反應(yīng)。
[0145] 12)蘇木素復(fù)染，
[0146] 13)酒精梯級脫水，切片干燥。
[0147] 14)滴加封片膠，相應(yīng)規(guī)格的蓋玻片蓋片，紫外燈下交聯(lián)切片lmin。
[0148] 1.7結(jié)果判斷及標(biāo)準(zhǔn)
[0149]應(yīng)用光學(xué)顯微鏡分別在低倍和高倍鏡下進(jìn)行觀察，首先觀察目標(biāo)RNA的陽性表達(dá) 信號在觀察目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)的定位:位于細(xì)胞核、細(xì)胞漿或細(xì)胞膜。
[0150]再分別以該檢測RNA表達(dá)部位陽性信號的強(qiáng)度和陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)兩種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行 綜合評分，判斷標(biāo)準(zhǔn)為：（1)依據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度判斷:a.細(xì)胞無染色，記0分;b.細(xì)胞染成 淺棕色為弱陽性，記1分;c.細(xì)胞染成棕色且無背景著色，或細(xì)胞染成深棕色并有淺棕色背 景為中等陽性，記2分;d.細(xì)胞染成深棕色且無背景著色為強(qiáng)陽性，記3分。（2)依據(jù)陽性細(xì)胞 表達(dá)數(shù)計(jì)分:a.無陽性細(xì)胞表達(dá)，記0分;b.陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)< 25%，記1分;c. 25% <陽性細(xì) 胞數(shù)<50 %，記2分;d.陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)2 50 %，記3分。
[0151] 為了盡量降低評分結(jié)果的主觀因素，由兩位病理學(xué)專家分別按上述標(biāo)準(zhǔn)之一各自 進(jìn)行判斷和評分，再將兩者評分相乘，結(jié)果為:①〇分者最終計(jì)為〇分，認(rèn)為陰性表達(dá);②1分 和2分者最終計(jì)為1分，認(rèn)為弱陽性表達(dá);③3分和4分者最終計(jì)為2分，認(rèn)為中等陽性表達(dá);④ 6分到9分者最終計(jì)為3分，認(rèn)為強(qiáng)陽性表達(dá)。
[0152] 1.8分析和統(tǒng)計(jì)軟件
[0153] 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用x2test或Fisher exact test，相關(guān)性分析采用Spearmen correlation方法;P<0.05即差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 生存曲線分析采用Kaplan-Meier method及l(fā)og-rank test;多變量分析采用Cox's proportional hazards model ;Ρ<0·05即差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0154] 2 結(jié)果
[0155] 2.1 L0C284454在鼻咽癌中的表達(dá)比正常對照組織中的表達(dá)顯著升高
[0156] L0C284454在79.5%的鼻咽癌組織中（79/112例)有表達(dá)，而僅在17.6% (34例慢性 炎癥上皮組織樣本中的6例）的正常鼻咽上皮組織中有表達(dá)（圖3)，兩者之間具有明顯的統(tǒng) 計(jì)學(xué)差異(P〈〇.〇〇l)。
[0157] 2.2 L0C284454高表達(dá)的鼻咽癌患者預(yù)后較差
[0158] 我們對112例鼻咽癌患者進(jìn)行了電話隨訪，詳細(xì)詢問了他們的首發(fā)時(shí)間、治療情 況、有無復(fù)發(fā)、有無再患其他疾病、復(fù)發(fā)及死亡時(shí)間等，并登記了生存時(shí)間和狀態(tài)，并對鼻咽 癌組織中L0C284454的表達(dá)與病人的生存時(shí)間和狀態(tài)進(jìn)行的生存分析，發(fā)現(xiàn)L0C284454高表 達(dá)患者總的生存時(shí)間和無病生存時(shí)間均明顯短于L0C284454低表達(dá)或不表達(dá)的患者（圖4)。 說明L0C284454是一個(gè)與鼻咽癌預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)記，該IncRNA表達(dá)高，病人預(yù)后差。
[0159] 實(shí)施例4，構(gòu)建shRNA載體干擾L0C284454的表達(dá)
[0160] 1.材料方法
[0161] 1.1試劑及試劑盒
[0162] 限制性內(nèi)切酶Hind III、Bgl II、EcoR I及Cla I，T4DNA連接酶等購自TakaRa公 司；
[0163] TRIZOL? Reagent(Invitrogen)；
[0164] 質(zhì)粒抽提試劑盒(#D6943_01，0MEGA);
[0165] 膠回收試劑盒(#M5212,0MEGA);
[0166] 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（#A3500，Promega);
[0167] 抗生素 G418(Ameresc)。
[0168] 1.2 shRNA的設(shè)計(jì)
[0169] 首先將L0C284454序列輸入Invitrogen公司的Block-It RNAi designer軟件，尋 找該IncRNA的shRNA最佳靶點(diǎn)，挑選最佳的3條相應(yīng)的靶點(diǎn)序列如下：
[0170] shRNA-Ι :GACTCAGAATCAGACCTGTGT如SEQ N0:16所示，
[0171] shRNA-2 :GCATAGATAGGTGGGTGAGTG如SEQ N0:17所示，
[0172] shRNA-3 :GACACAAGCAGGTGTGCTTAG如SEQ N0:18所示，
[0173] 以廣泛使用的在人類基因組中沒有任何靶點(diǎn)的Scramble序列作為陰性對照，其序 列如下：
[0174] Scramble:5'-GACACGCGACTTGTACCACHnSEQN0:19K*。
[0175] 針對這3條lncRNA^S序列，及Scramble序列，根據(jù)OligoEngine公司pSUPER載體 說明書，設(shè)計(jì)可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸單鏈及其反向互補(bǔ)序列，它們退火后即可形成兩 端分別帶限制性酶切位點(diǎn)Bglll和Hindlll粘性末端的DNA雙鏈。具體需合成的各條寡核苷 酸序列及它們配對退火后形成的DNA雙鏈如下：
[0176] shRNA-Ι：
[0177] 5'-GATCCCC GACTCAGAATCAGACCTGTGT TTCAAGAGA ACACAGGTCTGATTCTGAGTC TTTTTA-3'
[0178] 3'-GGG CTGAGTCTTAGTCTGGACACA AAGTTCTCT TGTGTCCAGACTAAGACTCAG AAAAATTCGA-5，
[0179] 如SEQ NO:20、21所示，
[0180] shRNA-2：
[0181] 5'-GATCCCC GCATAGATAGGTGGGTGAGTG TTCAAGAGA CACTCACCCACCTATCTATGC TTTTTA-3'
[0182] 3'-GGG CGTATCTATCCACCCACTCAC AAGTTCTCT GTGAGTGGGTGGATAGATACG AAAAATTCGA-5，
[0183] 如SEQ NO:22、23所示，
[0184] shRNA-3：
[0185] 5'-GATCCCC GACACAAGCAGGTGTGCTTAG TTCAAGAGA CTAAGCACACCTGCTTGTGTC TTTTTA-3'
[0186] 3'-GGG CTGTGTTCGTCCACACGAATC AAGTTCTCT GATTCGTGTGGACGAACACAG AAAAATTCGA-5,。
[0187] 如SEQ N0:24、25所示，
[0188] Scramble
[0189] 5'-GATCCCC GACACGCGACTTGTACCAC TTCAAGAGA GTGGTACAAGTCGCGTGTC TTTTTA-3，
[0190] 3'-GGG CTGTGCGCTGAACATGGTG AAGTTCTCT CACCATGTTCAGCGCACAG AAAAATTCGA-5，
[0191] 如SEQ NO:26、27所示。
[0192] 兩條互補(bǔ)配對的DNA退火后，左邊是限制性內(nèi)切酶Bgl II的粘性末端，右邊是Hind III的粘性末端。<