>[0086] 術(shù)語(yǔ)"野生型"在本發(fā)明的上下文中指的是可W在自然中發(fā)生或可分離自環(huán)境而 不攜帶任何遺傳工程改造突變的革蘭氏陰性細(xì)胞菌株。大腸桿菌野生型菌株的一個(gè)實(shí)例為 W3110,如 W3110K-12 菌株。
[0087] 任何合適的革蘭氏陰性細(xì)菌都可用作生產(chǎn)本發(fā)明重組細(xì)胞的親本細(xì)胞。合適的革 蘭氏陰性細(xì)菌包括鼠傷寒沙口氏菌（Salmonel la typhimurium)、巧光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens)、胡蘿h軟腐歐文氏菌化rwinia carotovora)、志賀桿菌 (化igella)、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae )、嗜肺軍團(tuán)菌化egionella pneumophila)、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、鮑氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii)及大腸桿菌。優(yōu)選地，親本細(xì)胞為大腸桿菌。大腸桿菌的任何合適菌株可用于本 發(fā)明，但優(yōu)選地所使用的為野生型W3110菌株，如K-12 W3110。
[0088] 與先前產(chǎn)生用W表達(dá)重組蛋白質(zhì)的蛋白酶缺陷細(xì)菌菌株相關(guān)的缺點(diǎn)為其包含參 與細(xì)胞新陳代謝及DNA復(fù)制的基因的其他突變，例如，大腸桿菌菌株中的phoA、fhuA、lac、 rec、gal、ara、arg、thi和pro。運(yùn)些突變可W對(duì)宿主細(xì)胞具有很多有害作用，包括對(duì)細(xì)胞生 長(zhǎng)、穩(wěn)定性、重組蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)量及毒性的作用。具有一種或多種運(yùn)些基因組突變的菌株， 特別是具有大量運(yùn)些突變的菌株可W顯示出喪失健康，運(yùn)使得細(xì)菌生長(zhǎng)速率降低到不適合 工業(yè)化蛋白質(zhì)生產(chǎn)的水平。進(jìn)一步地，任何W上基因組突變可不可預(yù)測(cè)的有害方式順 式和/或反式影響其他基因并由此改變菌株表型、健康W及蛋白質(zhì)概況。進(jìn)一步地，使用嚴(yán) 重突變的細(xì)胞一般不適合于生產(chǎn)用于商業(yè)化的重組蛋白質(zhì)，尤其是用于治療的蛋白質(zhì)，因 為運(yùn)些菌株一般具有缺陷的代謝途徑，因此在基本或化學(xué)限定的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)不良或根本 不生長(zhǎng)。
[0089] 根據(jù)本發(fā)明第二方面的細(xì)胞除了突變的spr基因 W及與野生型細(xì)胞相比降低Tsp 蛋白質(zhì)活性所需的修飾W外與野生型細(xì)菌細(xì)胞是同基因的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的細(xì)胞優(yōu) 選地除了突變的spr基因 W及野生型細(xì)胞相比降低Tsp蛋白質(zhì)活性所需的修飾W外與野生 型細(xì)菌細(xì)胞也是同基因的。對(duì)細(xì)胞的基因組只產(chǎn)生能夠引入運(yùn)些突變的最小突變。運(yùn)些細(xì) 胞不攜帶任何其他可W對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或表達(dá)目的蛋白質(zhì)能力有不利作用的突變。因此，相 比于包含對(duì)基因組序列有其他遺傳工程改造突變的細(xì)胞，根據(jù)本發(fā)明的一種或多種重組宿 主細(xì)胞展示了改進(jìn)的蛋白質(zhì)表達(dá)和/或改進(jìn)的生長(zhǎng)特征。相比于包含對(duì)細(xì)胞基因組的其他 破壞的細(xì)胞，本發(fā)明提供的細(xì)胞還更適合于用于產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)。
[0090] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，除了突變的spr基因 W及與野生型細(xì)胞相比降低Tsp蛋 白質(zhì)活性所需的修飾W外，所述細(xì)胞與野生型大腸桿菌細(xì)胞如菌株W3110是同基因的。
[0091] 本發(fā)明的細(xì)胞可由于包含編碼目的蛋白質(zhì)的多核巧酸而與野生型細(xì)胞有進(jìn)一步 的差異。編碼目的蛋白質(zhì)的多核巧酸序列可W為外源的或內(nèi)源的。編碼目的蛋白質(zhì)的多核 巧酸可包含在轉(zhuǎn)化入細(xì)胞和/或整合入宿主細(xì)胞基因組的合適的表達(dá)載體內(nèi)。在編碼目的 蛋白質(zhì)的多核巧酸插入宿主基因組的實(shí)施方式中，由于插入的編碼目的蛋白質(zhì)的多核巧 酸，本發(fā)明的細(xì)胞與野生型細(xì)胞也不同。優(yōu)選地，多核巧酸是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體中，因此對(duì) 宿主細(xì)胞基因組造成破壞最小。
[0092] spr蛋白質(zhì)為大腸桿菌的膜結(jié)合細(xì)胞周質(zhì)蛋白酶。
[0093] spr蛋白質(zhì)的野生型氨基酸序列顯示于具有在N-端的信號(hào)序列的SEQ ID N0:21及 不具有26個(gè)氨基酸的信號(hào)序列的SEQ ID N0:22(根據(jù)化iProt登記號(hào)P0AFV4)。本發(fā)明中spr 蛋白質(zhì)序列的氨基酸編號(hào)包括信號(hào)序列。因此，spr蛋白質(zhì)的1號(hào)氨基酸為顯示于SEQ ID NO :21中的第一個(gè)氨基酸(Met)。
[0094] 突變的spr基因優(yōu)選地為細(xì)胞的染色體spr基因。
[009引突變的spr基因編碼能夠抑制包含突變的Tsp基因的細(xì)胞的表型的spr蛋白質(zhì)。攜 帶突變的Tsp基因的細(xì)胞可具有良好的細(xì)胞生長(zhǎng)速率，但是運(yùn)些細(xì)胞的一個(gè)限制在于其易 于裂解，尤其在高細(xì)胞密度下。因此，包含突變的Tsp基因的細(xì)胞的表型為易于裂解，尤其在 高的細(xì)胞密度下。攜帶突變的Tsp基因的細(xì)胞還顯示了在低滲透壓下的熱敏型生長(zhǎng)方式。然 而，本發(fā)明的細(xì)胞所攜帶的spr突變?cè)谝刖哂薪档偷腡sp活性的細(xì)胞中時(shí)，抑制了降低的 Tsp表型，因此，（尤其在高細(xì)胞密度下)細(xì)胞顯示出裂解減少。在搖瓶或高細(xì)胞密度發(fā)酵技 術(shù)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地測(cè)量細(xì)胞的生長(zhǎng)表型。相比于攜帶Tsp突變體及野生型spr 的細(xì)胞，從提高的生長(zhǎng)速率和/或重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)(尤其是細(xì)胞周質(zhì)中）上可見(jiàn)攜帶spr突變 體及具有降低的Tsp活性的細(xì)胞展示出對(duì)細(xì)胞裂解表型的抑制。
[0096] 根據(jù)本發(fā)明第一個(gè)方面及第二方面一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式的細(xì)胞包含編碼spr蛋白 質(zhì)的突變的spr基因，其在選自N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、 0133、￥135、1^36、6140、1?144、化45、6147和化57的一個(gè)或多個(gè)氨基酸處具有突變，優(yōu)選地在 選自〔94、595、￥98、￥115、0133、￥135、化45、6147和化57的一個(gè)或多個(gè)氨基酸處具有突變。在 此實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不具有任何其他的突變。
[0097] 對(duì)一個(gè)或多個(gè)W上氨基酸的突變可W是對(duì)編碼所述氨基酸的一個(gè)、兩個(gè)或Ξ個(gè)核 巧酸的任何合適的錯(cuò)義突變。突變將氨基酸殘基變成任何合適的氨基酸，產(chǎn)生能夠抑制包 含突變的Tsp基因的細(xì)胞的表型的突變的spr蛋白質(zhì)。錯(cuò)義突變可將氨基酸變?yōu)橄啾扔谝吧?型氨基酸不同大小和/或具有不同化學(xué)特性的氨基酸。
[0098] 在一個(gè)實(shí)施方式中，突變體spr基因編碼的spr蛋白質(zhì)具有一個(gè)或多個(gè)選自C94A、 895尸、￥986、￥115。、01334、￥13抓或6、化454、6147(：和化574的突變。
[0099] 在一個(gè)實(shí)施方式中，突變是對(duì)C94、化45和化57構(gòu)成的催化單分子中的一個(gè)、兩個(gè) 或Ξ個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行的突變（Solution MVIR Shucture of the NlpC/P60 Domain of Lipoprotein Spr from Escherichia coli Structural Evidence for a Novel Cysteine Peptidase &1:alytic Triad,Biochemistry,2008,47,9715-9717)。
[0100] 因此，突變的spr基因可包含：
[0101] ?對(duì)C94的突變;或
[0102] ?對(duì)化45的突變;或
[0103] ?對(duì)化57的突變;或
[0104] ?對(duì)C94和H145的突變;或
[010引 ?對(duì)C94和化57的突變;或
[0106] ?對(duì)化45和化57的突變;或
[0107] ?對(duì) C94、H145 和 H157 的突變。
[0108] 在此實(shí)施方式中，SPR蛋白質(zhì)優(yōu)選地不具有任何其他突變。
[0109] C94、化45和化57中的一個(gè)、兩個(gè)或Ξ個(gè)可突變?yōu)槿魏魏线m的氨基酸，產(chǎn)生能夠抑 制包含突變的Tsp基因的細(xì)胞的表型的spr蛋白質(zhì)。例如，C94、H145和H157中的一個(gè)、兩個(gè)或 Ξ個(gè)可突變?yōu)樾“被崛鏕ly或Ala。因此，spr蛋白質(zhì)可具有C94A、H145A和H157A突變中的 一個(gè)、兩個(gè)或Ξ個(gè)。優(yōu)選地，spr基因包含錯(cuò)義突變H145A，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生能夠抑制包含突 變的Tsp基因的細(xì)胞的表型的spr蛋白質(zhì)。
[0110] 對(duì)本文的置換突變體的標(biāo)記由字母+數(shù)字+字母構(gòu)成。第一個(gè)字母標(biāo)記野生型蛋白 質(zhì)中的氨基酸。數(shù)字指的是進(jìn)行氨基酸置換的位置，第二個(gè)字母標(biāo)記用于置換野生型氨基 酸的氨基酸。
[0111] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，突變體spr蛋白質(zhì)包含在選自N31、R62、口 0、Q73、S95、 ￥98、999、3100、1^08、￥115、0133、￥135、1^36、6140、1?144和6147的一個(gè)或多個(gè)氨基酸處的突 變，優(yōu)選地為選自595、￥98、￥115、0133、￥135和6147的一個(gè)或多個(gè)氨基酸處的突變。在此實(shí) 施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不具有任何其他突變。因此，突變的spr基因可包含：
[0112] ?對(duì)N31的突變;或
[0113] ?對(duì)R62的突變;或
[0114] ?對(duì)口 0的突變;或
[0115] ?對(duì)Q73的突變;或
[0116] ?對(duì)S95的突變;或
[0117] ?對(duì)V98的突變;或
[011引 ?對(duì)Q99的突變;或
[0119] ?對(duì)R100的突變;或
[0120] ?對(duì)L108的突變;或
[0121] ?對(duì)Y115的突變;或
[0122] ?對(duì)D133的突變;或
[0123] ?對(duì)V135的突變;或
[0124] ?對(duì)L136的突變;或
[012引 ?對(duì)G140的突變;或
[0126] ?對(duì)R144的突變;或
[0127] ?對(duì)G147的突變。
[0128] 在一個(gè)實(shí)施方式中，突變體spr蛋白質(zhì)包含對(duì)W下氨基酸的多重突變：
[0129] ? 895和￥115;或
[0130] · N31、Q73、R100和G140;或
[0131] · Q73、R100和G140;或
[0132] ?R100 和 G140;或
[0133] ?Q73 和 G140;或
[0134] ?Q73 和 R100;或 [01巧]· R62、Q99和R144;或
[0136] · Q99和R144。
[0137] 氨基酸 N3UR62、口0、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、 R144和G147中的一個(gè)或多個(gè)可突變?yōu)槿魏魏线m的氨基酸，產(chǎn)生能夠抑制包含突變的Tsp基 因的細(xì)胞的表型的spr蛋白質(zhì)。例如，N31、R62、I70、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、 0133、￥135、1^36、6140和1?144中的一個(gè)或多個(gè)可突變?yōu)樾“被崛?17或41曰。
[0138] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)包含W下突變中的一個(gè)或多個(gè):N31Y、R62C、 口 01\9731?、595尸、￥986、999?、則006、1^085、￥115尸、01334、￥13加或￥1356、1^36?、6140(：、 R144C和G147C。優(yōu)選地，SPR蛋白質(zhì)包含W下突變中的一個(gè)或多個(gè)：S95F、V98E、Y115F、 D133A、V13抓或V135G和G147C。在此實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不含有任何其他突變。
[0139] 在一個(gè)實(shí)施方式中，spr 蛋白質(zhì)具有選自 N31Y、R62C、口 0T、Q73R、S95F、V98E、Q99P、 1?1006、1^085、￥115尸、01334、￥13加或￥1356、1^36口、6140(：、1?144(：和6147(：的一個(gè)突變。在此 實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不具有任何其他突變。
[0140] 在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方式中，spr蛋白質(zhì)具有多重突變，選自：
[0141] ?S95F 和 Y115F;
[0142] · N31Y、Q73R、R100G和G140C;
[0143] · Q73R、R100G和G140C;
[0144] · R100G和G140C;
[0145] · Q73R和G140C;
[0146] ?Q73R 和 R100G;
[0147] · R62C、Q99P和R144C;或 [014引· Q99P和R144C。
[0149] 優(yōu)選地，突變體spr基因編碼的spr蛋白質(zhì)具有選自化45A、化57A和D133A的突變。
[0150] 在本發(fā)明的第二方面，可對(duì)spr基因產(chǎn)生任何合適的一種或多種突變W產(chǎn)生能夠 抑制包含突變的Tsp基因的細(xì)胞的表型的spr蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，spr蛋白質(zhì)可具有一個(gè)或多個(gè) W 下突變：N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、 V13 加、￥1356、1^36口、6140(：、1?144(：、化454、6147(：、化574和胖1741?。在一個(gè)實(shí)施方式中，3口'蛋 白質(zhì)不包含突變W174R。優(yōu)選地，spr基因包含一個(gè)或多個(gè)上文討論的與本發(fā)明第一個(gè)方面 相關(guān)的突變。
[0151] 根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞具有相比于野生型細(xì)胞降低的Tsp蛋白質(zhì)活性。詞句"相比于野 生型細(xì)胞降低的Tsp蛋白質(zhì)活性"指的是所述細(xì)胞的Tsp活性相比于野生型細(xì)胞的Tsp活性 有所降低。細(xì)胞可W任何合適的方式修飾而降低其Tsp活性。
[0152] 在一個(gè)實(shí)施方式中，降低的Tsp活性源于對(duì)編碼Tsp的內(nèi)源多核巧酸和/或相關(guān)調(diào) 控表達(dá)序列的修飾。所述修飾可降低或終止Tsp基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，或可提供表達(dá)的Tsp蛋白 質(zhì)相比于野生型Tsp蛋白質(zhì)具有降低蛋白酶活性。
[0153] 在一個(gè)實(shí)施方式中，相關(guān)的調(diào)控表達(dá)序列受到修飾W降低Tsp表達(dá)。例如，Tsp基因 的啟動(dòng)子可W突變W阻止此基因的表達(dá)。
[0154] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞攜帶編碼具有降低的蛋白酶活性的 Tsp蛋白質(zhì)的突變的Tsp基因或敲除突變的Tsp基因。
[0155] 優(yōu)選地，染色體Tsp基因受到突變。
[0156] 如本文所使用的，"Tsp基因"指的是編碼蛋白酶Tsp(也稱為Prc)的基因，其為一種 細(xì)胞周質(zhì)蛋白酶，能夠作用于青霉素結(jié)合蛋白質(zhì)-3(PBP3)及隧菌體尾己蛋白質(zhì)。野生型Tsp 基因的序列顯示于SEQ ID N0:1，野生型Tsp蛋白質(zhì)序列顯示于SEQ ID N0:2。
[0157] 除非另有說(shuō)明，提到突變的Tsp基因或編碼Tsp的突變的Tsp基因指的是編碼具有 降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白質(zhì)的突變的Tsp基因或者敲除突變的Tsp基因。
[0158] 在本發(fā)明的上下文中，詞句"編碼具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白質(zhì)的突變的 Tsp基因"指的是相比于野生型非突變的Tsp基因，突變的Tsp基因不具有完全的蛋白酶活 性。
[0159] 優(yōu)選地，突變的Tsp基因編碼的Tsp蛋白質(zhì)具有野生型非突變Tsp蛋白質(zhì)的50%或 更低、40 %或更低、30 %或更低、20 %或更低、10 %或更低、或者5 %或更低的蛋白酶活性。更 優(yōu)選地，突變的Tsp基因編碼不具有蛋白酶活性的Tsp蛋白質(zhì)。在此實(shí)施方式中，細(xì)胞沒(méi)有染 色體Tsp缺陷，即，Tsp基因序列未經(jīng)刪除或突變W阻止任何形式的Tsp蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0160] 任何合適的突變可引入Tsp基因 W產(chǎn)生具有降低的蛋白酶活性的蛋白質(zhì)。自革蘭 氏陰性細(xì)菌表達(dá)的Tsp蛋白質(zhì)的蛋白酶活性可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)任何本領(lǐng)域合 適的方法進(jìn)行測(cè)試，如描述于Keiler等人（Identification of Active Site Residues of the Tsp Protease*T皿 JOURNAL OF BIOLOGICAL C肥MISTRY Vol.270,No.48,Issue of December l,pp.28864-28868,1995 Kenneth C.Keiler 和Robert T.Sauer)的方法，其中 測(cè)試了 Tsp的蛋白酶活性。
[0161] Keiler等人(見(jiàn)上文）已經(jīng)報(bào)道Tsp的活性位點(diǎn)包含殘基S430、D441和K455,且殘基 G375、G376、E433和T452對(duì)維持Tsp的結(jié)構(gòu)很重要。Keiler等人(見(jiàn)上文)報(bào)道其發(fā)現(xiàn)突變的 Tsp 基因 54304、04414、1(4554、1(455山1(4551?、63754、63764、64334和了4524不可檢測(cè)到蛋白酶 活性。進(jìn)一步報(bào)道突變的Tsp基因 S430C顯示出野生型活性的大約5-10%。因此，產(chǎn)生具有降 低的蛋白酶活性的蛋白質(zhì)的Tsp突變可包含突變，如對(duì)殘基S430、D441、K455、G375、G376、 E433和T452中的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)行錯(cuò)義突變。優(yōu)選地，產(chǎn)生具有降低的蛋白酶活性的蛋白質(zhì) 的Tsp突變可包含突變，如對(duì)殘基S430，D441和K455中的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)行錯(cuò)義突變。
[0162] 因此，突變的Tsp基因可包含：
[0163] ?對(duì)S430的突變;或
[0164] ?對(duì)D441的突變;或
[016引 ?對(duì)K455的突變;或
[0166] ?對(duì)S430和D441的突變;或
[0167] ?對(duì)S430和K455的突變;或
[016引 ?對(duì)D441和K455的突變;或
[0169] ?對(duì) S430、D441 和 K455 的突變。
[0170] 8430、0441、1(455、6375、6376、6433和了452中的一個(gè)或多個(gè)可突變?yōu)槿魏魏线m的氨 基酸，產(chǎn)生具有降低的蛋白酶活性的蛋白質(zhì)。合適的突變的實(shí)例為S430A、S430C、D441A、 1(4554、1(455山1(4551?、63754、63764、64334和了4524。突變的了39基因可包含對(duì)活性位點(diǎn)殘基 的一個(gè)、兩個(gè)或Ξ個(gè)突變，例如基因可包含：
[0171] · S430A或S430C;和/或
[0172] ?〇44心;和/或
[0173] · K455A或K455H或K455R。
[0174] 優(yōu)選地，Tsp基因包含點(diǎn)突變S430A或S430C。
[0175] 在本發(fā)明上下文中，詞句"敲除突變的Tsp基因"指的是所述基因包含一種或多種 突變，運(yùn)阻止由野生型基因編碼的Tsp基因的表達(dá)，提供了的Tsp蛋白質(zhì)的細(xì)胞缺陷。敲除基 因可部分或全部地轉(zhuǎn)錄，但不翻譯為編碼的蛋白質(zhì)。敲除突變的Tsp基因可W任何合適的方 式，例如通過(guò)刪除、插入、點(diǎn)突變、錯(cuò)義、無(wú)義及移碼突變中一種或多種方式進(jìn)行突變，使得 蛋白質(zhì)不表達(dá)。例如，基因可通過(guò)將外源DNA序列如抗生素抗性標(biāo)記物插入基因編碼序列而 被敲除。
[0176] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，Tsp基因不是通過(guò)將外源DNA序列如抗生素抗性標(biāo)記物 插入基因編碼序列而突變的。在此實(shí)施方式中，Tsp基因可包含對(duì)基因起始密碼子的突變 和/或位于基因起始密碼子下游、基因終止密碼子上游的一個(gè)或多個(gè)終止密碼子，由此阻止 Tsp蛋白質(zhì)表達(dá)。對(duì)起始密碼子的突變可為起始密碼子核巧酸中一個(gè)、兩個(gè)或所有Ξ個(gè)核巧 酸的錯(cuò)義突變。備選地或另外地，起始密碼子可通過(guò)插入或刪除移碼突變進(jìn)行突變。Tsp基 因在編碼序列的5'末端包含兩個(gè)ATG密碼子，其中兩個(gè)ATG密碼子之一或全部可通過(guò)錯(cuò)義突 變而進(jìn)行突變。Tsp基因可在第二個(gè)ATG密碼子(3號(hào)密碼子)處突變?yōu)門CG，如圖Ub所示。Tsp 基因可備選地或另外地包含位于基因起始密碼子下游、基因終止密碼子上游的一個(gè)或多個(gè) 終止密碼子。優(yōu)選地，敲除突變的Tsp基因包含對(duì)起始密碼子的錯(cuò)義突變W及一個(gè)或多個(gè)插 入的終止密碼子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，Tsp基因可突變W刪除第五個(gè)密碼子中的?'而形 成移碼，在11和16號(hào)密碼子處產(chǎn)生終止密碼子，如圖Ub所示。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，Tsp還 可突變?yōu)椴迦階se I限制性位點(diǎn)而在21號(hào)密碼子處產(chǎn)生第Ξ個(gè)框內(nèi)終止密碼子，如圖Ub所 /J、- 〇
[0177] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，敲除突變的Tsp基因具有SEQ ID NO: 3的DNA序列，其包 括起始密碼子上游的6個(gè)核巧酸ATGAAT。SEQ ID NO: 3的敲除突變Tsp序列中所作出的突變 顯示于圖1化。在一個(gè)實(shí)施方式中，突變的Tsp基因具有SEQ ID N0:3的7-2048號(hào)核巧酸的 DNA序列。
[0178] 在一個(gè)實(shí)施方式中，重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼化bC的重組多核巧 酸。編碼化bC的重組多核巧酸可存在于轉(zhuǎn)化入細(xì)胞和/或整合入宿主細(xì)胞基因組的合適的 表達(dá)載體上。在其中編碼DsbC的重組多核巧酸插入宿主基因組的實(shí)施方式中，由于插入的 編碼化bC的重組多核巧酸，本發(fā)明的細(xì)胞也與野生型細(xì)胞不同。優(yōu)選地，編碼化bC的重組多 核巧酸是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體中，因此對(duì)宿主細(xì)胞基因組造成破壞最小。
[0179] 如本文所使用的，"重組多膚"指的是使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建或產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。編碼 化bC的多核巧酸序列可與細(xì)菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的編碼DsbC的內(nèi)源序列同一。備選地，編碼DsbC 的重組多核巧酸序列為野生型DsbC序列的突變形式，例如，具有移除的限制性位點(diǎn)，如 EcoRI位點(diǎn)，和/或具有編碼his標(biāo)簽的序列。
[0180] 化bC是一種發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)中的原核蛋白質(zhì)，其催化大腸桿菌中二硫鍵 的形成。DsbC的氨基酸序列長(zhǎng)度為236(包括信號(hào)膚），分子量為25.6KDa(UniProt No.P0AEG6)eDsbC于 1994年首次發(fā)現(xiàn)(Missiakas等人The Escherichia coli dsbC(xprA) gene encodes a periplasmic protein involved in disulfide bond formation,The EMB0Jou;rnalvoll3,no8,p2013-2020,1994W及化evchik等人化aracte;rizationof DsbC,a periplasmic protein of Erwinia chrysanthemi and Escherichia coli with