Pinori，M.，Verdini，A. S.和Viscomi， G.C. (1987)"含有反倒型肽鍵的肽的完全固相合成，使用交聯(lián)肌氨酸基共聚物作為支持 物"、歐洲專利97994-B中有描述。
[0053] 通常，L-氨基酸通過使用大寫體命名，而D-型氨基酸使用小寫體命名。本發(fā)明的肽 和肽衍生物按照它們的優(yōu)選形式命名，但是并不限制它們?yōu)檫@些優(yōu)選形式。本發(fā)明第一個(gè) 方面的肽被指定為包含WDLYFEIVW(SEQ ID N0:1)或其變體。本發(fā)明第一個(gè)方面的肽也可以 是WDLYFEIVW(SEQ ID N0:1)或其變體的反倒型變體，即wviefyldw或其變體。本發(fā)明第二個(gè) 方面的肽被指定為包含cimfwydcye或其變體。
[0054] 通常，如果氨基酸被通過肽鍵連接，則肽被表示為N-端氨基出現(xiàn)在左側(cè)并且C-端 羧基出現(xiàn)在右側(cè)。根據(jù)本發(fā)明的肽和肽衍生物被用這樣的方式表示。
[0055] "肽衍生物"含有一個(gè)以上氨基酸殘基的修飾或者連接物基團(tuán)或其他共價(jià)連接基 團(tuán)。
[0056] 衍生物的例子包括:氨基末端或另一種游離氨基的N-?；苌铩Ⅳ然┒嘶蛄?一種游離羧基或羥基的酯、羧基末端或另一種游離羧基的酰胺(通過與氨反應(yīng)或與合適胺 類反應(yīng)而生產(chǎn)）、糖基化衍生物、羥基化衍生物、核苷酸基化衍生物、ADP-核糖基化衍生物、 PEG化衍生物、磷酸化衍生物、結(jié)合于親脂性部分的衍生物、以及結(jié)合于抗體或其他生物學(xué) 配體的衍生物。在化學(xué)衍生物中還包括那些通過肽鍵-⑶-NH-修飾例如通過還原成-CH2-NH-或者烷基化成-C0-N (烷基)-而獲得的衍生物。
[0057]優(yōu)選的衍生物是C-端酰胺化。肽的C-端酰胺化除去了 C-端的負(fù)電荷。具有C-端酰 胺的肽衍生物用在c-端處"NH2"表示，例如Ac-(乙酰)WDLYFEIW-NH2 (SEQ ID NO: 1)。另一種 優(yōu)選的衍生物是N-端乙?；?。這要除去N-端的正電荷。封閉C-端或N-端，比如通過C-端酰胺 化或者N-端乙?；?，由于降低了對(duì)外部蛋白水解消化(exoproteolytic digestion)的敏感 性，所以可以改進(jìn)蛋白水解穩(wěn)定性。
[0058]合適的連接物包括柔韌的連接物4,7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺(Ttds)、甘氨 酸、6-氨基己酸、β-丙氨酸、或者Ttds、甘氨酸、6-氨基己酸和β-丙氨酸的組合。
[0059]本發(fā)明的肽能夠通過如下方法制備:化學(xué)合成、DNA重組技術(shù)、較大分子的生物化 學(xué)法或酶法分裂、上述方法的組合，或者通過任何其他的方法制備。
[0060]肽（至少在氨基酸殘基之間含有肽鍵的那些肽）可以通過下述文獻(xiàn)和其中參照文 獻(xiàn)中描述的Fmoc策略的固相肽合成法合成：《Fmoc固相肽合成-實(shí)用的方法》。W. C. Chan， P. D. Whi te編，牛津大學(xué)出版社，紐約，2000。通過9-芴基甲氧羰基(Fmoc)基團(tuán)提供臨時(shí)N-氨 基保護(hù)。通過使用在N，N-二甲基甲酰胺中20%哌啶來影響該高度堿基不穩(wěn)定的保護(hù)基的重 復(fù)性切割。側(cè)鏈官能團(tuán)可以被保護(hù)為它們的丁基醚(對(duì)于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的情況）、 丁基酯（就谷氨酸和天冬氨酸而言）、丁氧羰基衍生物（就賴氨酸和組氨酸而言）、三苯甲基 衍生物(就半胱氨酸、天門冬酰胺和谷氨酰胺而言)和4-甲氧基_2,3,6_三甲苯磺?；苌?物(就精氨酸而言）。固相支持物是基于聚二甲基丙烯酰胺聚合物，該聚合物由三種單體組 成:二甲基丙烯酰胺(骨架-單體）、二丙烯酰乙烯二胺(交聯(lián)劑)和丙烯酰肌氨酸甲酯（功能 化試劑）。使用的肽-樹脂可裂解的連接試劑是酸不穩(wěn)定性的4-羥甲基-苯氧基乙酸衍生物， 或者在C-端酰胺的情況下是Rink-酰胺連接物。除天門冬酰胺和谷氨酰胺之外，所有氨基酸 衍生物被加入作為它們的預(yù)成型對(duì)稱的酸酐衍生物，天門冬酰胺和谷氨酰胺是通過使用反 向N，N-二環(huán)己基-碳二亞胺/1-羥基苯并三唑介導(dǎo)的偶聯(lián)工藝被加入的。所有偶聯(lián)和去保護(hù) 反應(yīng)通過使用水合茚三酮、三硝基苯磺酸或者isotin測(cè)試步驟進(jìn)行監(jiān)控。一旦合成完成，通 過用含有50%清除劑混合物的95%三氟乙酸處理，肽就從樹脂支持物上解離，伴隨除去側(cè) 鏈保護(hù)基。常用的清除劑是乙烷二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，精確的選擇取決于被合成肽的 組分氨基酸。通過在真空下蒸發(fā)除去三氟乙酸，隨后用二乙醚研制，得到粗肽。本發(fā)明的任 何清除劑都可以通過簡(jiǎn)單的提取工藝被除去，水相凍干時(shí)得到不含清除劑的粗肽。用于肽 合成的試劑一般地可以購(gòu)自Calbiochem-Novabiochem(英國(guó)）有限公司，諾丁漢NG72QJ，英 國(guó)。純化可能會(huì)受到下述技術(shù)中的任何一個(gè)、或其組合的影響：比如，大小排阻色譜法、離子 交換層析、親和色譜法、差別溶解度法和(主要地)反相高效液相色譜法。通過使用薄層色層 分析法、反相高效液相色譜法、酸水解后氨基酸分析并且通過快原子轟擊(Fab)質(zhì)譜分析， 可以進(jìn)行肽的分析。
[0061] 也可能使用SPOT-合成法，其允許可設(shè)定位置，是在連續(xù)纖維素膜上肽的化學(xué)合成 法（R.Frank，Tetrahedron.(1992)48,9217)〇
[0062] 作為固相肽合成技術(shù)的替換，也可以通過重組體蛋白表達(dá)或者體外翻譯系統(tǒng)而產(chǎn) 生肽(Sambrook等，《分子克隆：實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》。2001，第三版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐 約）。當(dāng)然，僅是肽含有通過天然產(chǎn)生的肽鍵連接的可被多核苷酸編碼的天然產(chǎn)生的氨基酸 殘基。就固相肽合成技術(shù)而言這些方法是優(yōu)選的，其中肽尤其是大肽，比如大于50個(gè)氨基 酸、或者大于1〇〇個(gè)氨基酸。
[0063] -種"變體"氨基酸序列作為相對(duì)于本發(fā)明的第一個(gè)方面的限定，可以包含在 WDLYFEIVW(SEQ ID N0:1)中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)L-氨基酸取代。
[0064] 優(yōu)選地，變體氨基酸序列包含一種氨基酸序列，其包含XXX2X3YX4EX5X6X7,其中Xl是 W、L或P;X2是D或S;X3是L或F;X4是？、卩1^、1^3匕￥、？打、11111附、!1作3〇6或0^ ;父5是1或卩;父6是 S、V或G;并且X7是W或L(SEQ ID N0:1)。
[0065] 更優(yōu)選地，變體氨基酸序列包含一種氨基酸序列，其包含XXX2X3YX4EX5X6X7,其中Xl 是W或L;X2是D或S;X3是L或F;X4是F、Phg或L;X5是I或F;X 6是S、V或G;并且X7是W或L(SEQ ID Ν0：1)〇
[0066] -種"變體"氨基酸序列作為相對(duì)于本發(fā)明的第二個(gè)方面的限定，可以包含在 imfwydcy e中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)氨基酸取代。
[0067] 優(yōu)選地，在imfwydcye中的至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)所述的取代是 D-型氨基酸。
[0068]在該變體內(nèi)部的任何取代可以是非保守型的或者保守型的。
[0069] 對(duì)于術(shù)語(yǔ)"保守性取代"，我們是指在下組內(nèi)部的取代：Val、Ile、LeU、Ala、Met; Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr、Gly、Ala;Lys、Arg、His;以及Phe、Tyr、Trp〇
[0070] 優(yōu)選地，本發(fā)明第一個(gè)方面的肽或者肽衍生物包含RMEH)VWDLYFEIVW(SEQ ID NO: 2)或RMKFDVWDLYFEIVW(SEQ ID N0:2);或者一種變體氨基酸序列，其包含在 RMEH)VWDLYFEIVW(SEQ ID N0:2)或RMKFDVWDLYFEIVW(SEQ ID N0:2)中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、 四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)氨基酸取代。
[0071] 為了避免引起疑義，序列RMEFDVWDLYFEIVW(SEQIDN0:2)可以通過使用三個(gè)字母 的氨基酸代碼被表不為 Arg-Met-Glu-Phe-Asp-Val-Trp-Asp-Leu-Tyr-Phe-Glu-Ile-Val-TrpAMKFDVWDLYFEIVWUEQ ID N0:2)可以通過使用三個(gè)字母的氨基酸代碼被表示為Arg-Met-Lys-Phe-Asp-Val-Trp-Asp-Leu-Tyr-Phe-Glu-Ile-Val-Trp〇
[0072] 更優(yōu)選地，變體氨基酸序列包含一種氨基酸序列，其包含XsXsXKjFDVXiX^^YXaEXsXs X7，其中 Xs是R或P; X9是Μ、Nva、Moo、N、N1 e、Meo、Q、Eag; Χ?ο是E、K或D; Χι是 W、L或P; χ2 是D或 S; χ3 是L或F; X4是F、Phg、L、Ebw、Pf f、Thi、INi、Hf e、Ece、Cha; X5 是 I 或F; X6是 S、V或G;并且X7是W或 L(PEQ ID N0：2)〇
[0073] 更優(yōu)選地，變體氨基酸序列包含一種氨基酸序列，其包含XsXsXKjFDVXiX^^YXaEXsXs X7，其中Xs是R或P; X9是Μ或Nva; X1Q是E、K或D; 乂:是胃或L; X2是D或S; X3是L或F; X4是F、Phg或L; X5是I或F;X6是S、V或G;并且X7是W或L(SEQ ID N0:2)。
[0074] 適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明第一個(gè)方面的肽或者肽衍生物肽是在下表中所示的肽或者肽衍生 物，或者包含、或者由在下表1至3中所示的肽或者肽衍生物的氨基酸序列組成：
[0075]表1:最優(yōu)選的肽



[0083] 在上述各表中，-ttds-是4,7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺。"N"是天門冬酰胺。 "NH2"是C-端酰胺基。
[0084] 優(yōu)選地，本發(fā)明第一個(gè)方面的肽或者肽衍生物不包含、或者不由下列中所示的肽



[0085]優(yōu)選地，本發(fā)明第二個(gè)方面的肽或者肽衍生物包含：
[0086] (i)氨基酸序列，其包含cimfwydcye;或
[0087] (ii)變體氨基酸序列，其包含在cimfwydcye中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)、五個(gè)、六 個(gè)或七個(gè)氨基酸取代。
[0088] 優(yōu)選地，在cimfwydcye中的至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)或七個(gè)所述的 取代是D-型氨基酸。
[0089]優(yōu)選地，本發(fā)明第二個(gè)方面的肽或者肽衍生物包含：一種氨基酸序列，其包含 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X1。，其中 Χι，當(dāng)存在時(shí)，是c、s、y、i、D-Pen、C、t、D-Nva、D-Nl e或k; X2是 i、y、 w或d;X3是c或m;X4是f、t、v或c ;X5是w或 c;X6 是y或c ;X7是d、e或f;X8 是c、e、f、y 或d;Xg 是y或 w;并且Χ?ο是e或i，其與cimfwydcye相比具有不超過七個(gè)氨基酸取代。
[0090] 優(yōu)選地，肽或者肽衍生物包含一種氨基酸序列，其包含XiXdsXAwydXsye，其中，乂!是 (3、〇、0-?611或8;乂2是：[、7或￥;乂3是(3或111;乂4是；^、1：、或￥;并且乂8是(3或6。
[0091] 優(yōu)選地，該肽或者肽衍生物包含一種氨基酸序列，其包含XiXMXawydXsye，其中，X! 是c、C、或D-Pen ;X2是i或y ;X4是f、t、或v;并且X8是c或e。
[0092] 適當(dāng)?shù)兀景l(fā)明第二個(gè)方面的肽或者肽衍生物是在下表中所示的肽或者肽衍生 物，或者包含、或者由在下表4至6中所示的肽或者肽衍生物的氨基酸序列組成：
[0093]表4:最優(yōu)選的肽
[0095] 在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，肽肋5、806、814、815、817、818、834、835和837是環(huán)狀 肽。
[0096]表5:優(yōu)選的肽

[0098]在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，肽826、827、828、830、831、8332333、836、838和839是 環(huán)狀肽。
[0099] 表6:活性肽
[0101] 在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，肽卻1、802、811、825和829是環(huán)狀肽。
[0102] 在上述各表中，-TTDS-是4，7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺。"NH2"是C-端酰胺基。 [0103]在上述各表中，B08被刪除，因?yàn)槠渑cB01相同。在上述各表中，B12被刪除，因?yàn)槠?與B02相同。
[0104]優(yōu)選地，本發(fā)明第一個(gè)方面的肽或者肽衍生物不包含、或者不由下列中所示的肽

[0105] 優(yōu)選地，本發(fā)明第二個(gè)方面的肽或者肽衍生物是環(huán)狀肽。第一個(gè)方面的肽或者肽 衍生物也可以是環(huán)狀的。
[0106] 在此使用的術(shù)語(yǔ)"環(huán)狀肽"指的是肽的環(huán)狀衍生物，其上例如經(jīng)常在羧基末端和在 氨基末端已經(jīng)添加了兩個(gè)以上附加的適合環(huán)化的基團(tuán)。合適的基團(tuán)包括氨基酸殘基。環(huán)狀 肽可能或者含有分子內(nèi)的二硫鍵即-s-s-、在兩個(gè)加入的殘基之間的分子內(nèi)酰胺鍵即-C0NH-或-NHC0-;或者含有分子內(nèi)的S-烷基鍵即-S- (CH2) n-CONH-或-NH-C0 (CH2) n-S-，其中， η是1、2或更多并且優(yōu)選不大于6。也可以通過在Scharn，D.等(2001)J.0rg.Chem.66;507* 例舉的三嗪化學(xué)技術(shù)進(jìn)行環(huán)化。環(huán)狀肽序列用在肽序列前面的詞頭"環(huán)"表示，而序列的環(huán) 部分被并入括號(hào)中并且另外通過連字符與序列的其余部分分離。
[0107] 本發(fā)明的第一個(gè)方面或第二個(gè)方面的肽或者肽衍生物可以通過結(jié)合于聚乙二醇 (PEG)而被修飾。合適的PEG化方法在美國(guó)專利No.5，122,614(Zalipsky;Enzon公司）和5， 539，063 (Hakimi等;Hof fmann-La羅氏公司）中公開，將其所有PEG化方法引入本發(fā)明作為參 考。可以使用各種分子量的PEG，適當(dāng)?shù)貫閺?000至40000kD。優(yōu)選的分子量是5000kD。優(yōu)選 PEG是單分散的，意思指在PEG分子之間分子量有很少變化。PEG化可以改進(jìn)的溶解性和肽的 血衆(zhòng)半衰期。
[0108] 本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了一種二元肽，其包含本發(fā)明第一個(gè)方面或第二個(gè)方面 的一種肽或者肽衍生物，所述一種肽或者肽衍生物結(jié)合于另一種本發(fā)明第一個(gè)方面或第二 個(gè)方面的肽或者肽衍生物，其中，所述一種肽或者肽衍生物可以與所述另一種肽或者肽衍 生物相同或者不同，并且其中該二元肽具有促凝血活性。
[0109] 該二元肽可以包含兩個(gè)相同的彼此共價(jià)連接的本發(fā)明第一個(gè)方面或第二個(gè)方面 的肽或者肽衍生物，或者兩個(gè)不同的彼此共價(jià)連接的肽或者肽衍生物。該共價(jià)連接或者是 通過柔韌的連接物，其可能是肽、擬肽或非肽;或者是通過構(gòu)象約束連接物，其可能包含構(gòu) 象上被約束的肽、擬肽或非肽的構(gòu)件例如三嗪部分;或者是通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的任何其 他可能的方法。
[0110] 優(yōu)選地，本發(fā)明第一個(gè)方面和第二個(gè)方面的肽或者肽衍生物和本發(fā)明第三個(gè)方面 的二元肽的分子量在0.5和3.5kD之間。對(duì)于術(shù)語(yǔ)"分子量"，我們是指肽或者肽衍生物的單 體的理論質(zhì)量，不包括任何反離子或加合物在內(nèi)。對(duì)于PEG化肽，分子量定義為單體分子的 質(zhì)量，不包括任何反離子或加合物在內(nèi)，并且不包括PEG部分在內(nèi)。在0.5kD和3.5kD之間的 肽、肽衍生物和二元肽比更大的肽更容易合成，具有降低的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，并且一般容易給 藥于病人。小于〇.5kD的肽可能容易合成并給藥，并且很少會(huì)是免疫原性的，但是可能不具 有所要求的促凝血活性。盡管如此，如果它們具有適當(dāng)?shù)幕钚?，小于?5kD和大于3.5kD的 肽、肽衍生物和二元肽也被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0111] 本發(fā)明第一個(gè)方面和第二個(gè)方面的肽和肽衍生物和本發(fā)明第三個(gè)方面的二元肽 具有促凝血活性。
[0112]對(duì)于術(shù)語(yǔ)"促凝血活性"，我們是指在合適的測(cè)試體系中促進(jìn)凝血酶產(chǎn)生和/或纖 維蛋白沉積的能力。
[0113] 優(yōu)選不同的測(cè)定法可以用來確定促凝血活性。實(shí)際上，有不同類型的促凝血活性。 肽和肽衍生物可以促進(jìn)在FV、FVII、FVII I、FX或FXI減少的血漿中的凝血。在一種優(yōu)選實(shí)施 方式中，本發(fā)明的肽或者肽衍生物促進(jìn)在其中FVIII減少或缺失的血漿中的凝血酶產(chǎn)生和/ 或纖維蛋白沉積。該活性類型被認(rèn)為是凝血FVIII活性。如果血漿是來自缺乏FVIII的個(gè)體， 則該活性典型地被稱作FVIII當(dāng)量活性。如果血漿含有抗FVIII的抑制劑，則該活性典型地 被稱作FVIII抑制劑旁路當(dāng)量活性。其他的促凝血活性包括FV活性、FVII活性、FX活性和FXI 活性。
[0114] 單個(gè)的肽和肽衍生物在不同類型的測(cè)定法之間的相對(duì)效力可以改變。因此，即使 肽或者肽衍生物在特定的測(cè)定中顯示具有低效力，然而其也可以在另一種測(cè)定中具有適當(dāng) 高水平的促凝血活性。
[0115] 確定促凝血活性的合適測(cè)定法是如下所述的限定內(nèi)在凝血酶產(chǎn)生測(cè)定。在該測(cè)定 中，如果一種化合物能夠以25、50或100μπι的濃度在60分鐘內(nèi)、并且優(yōu)選在50、40、30、20或10 分鐘內(nèi)刺激產(chǎn)生5ηΜ凝血酶，則該化合物被認(rèn)為具有促凝血活性。優(yōu)選其能夠在60分鐘內(nèi)、 并且更優(yōu)選在50、40、30、20或10分鐘內(nèi)刺激產(chǎn)生ΙΟηΜ凝血酶。另一個(gè)可選的測(cè)定法是如下 所述的限定二元路徑凝血酶產(chǎn)生測(cè)定（Defined Dual-Pathway Thrombin Generation Assay)。在該測(cè)定中，如果一種化合物能夠以25、50或100μΜ的濃度在70分鐘、優(yōu)選60、50、 40、30或20分鐘內(nèi)刺激產(chǎn)生5ηΜ凝血酶，則其被認(rèn)為具有促凝血活性。優(yōu)選其能夠在70分鐘、 并且更優(yōu)選60、50、40、30或20分鐘內(nèi)刺激產(chǎn)生10ηΜ凝血酶。對(duì)于確定凝血FVII I活性，上述 的測(cè)定法尤其有用，因?yàn)樗鼈兛梢栽贔VIII減少或受抑制的血漿存在的條件下進(jìn)行。然而， 通過合適減少或抑制的血漿代替FVIII減少或受抑制的血漿，它們能夠被容易地適合于對(duì) 其他類型促凝血活性的測(cè)試。
[0116] 適當(dāng)?shù)兀倌钚允窃谙薅▋?nèi)在凝血酶產(chǎn)生測(cè)定中25、50或100μΜ的化合物的凝 血酶產(chǎn)生時(shí)間，相當(dāng)于至少lOOmU/mLFVIII抑制物旁路活性(FEIBA)、優(yōu)選至少300mU/mL FEIBA、