射和載體10ml/kg靜脈 內(nèi)注射之間沒有統(tǒng)計學上的顯著性(在5%水平)差異。在給藥所研究藥物之后60分鐘內(nèi)，在 心率的AUC中在AO 1 20mg/kg靜脈內(nèi)注射和鹽水10ml/kg靜脈內(nèi)注射之間、以及在AO 1 20mg/ kg靜脈內(nèi)注射和載體10ml/kg靜脈內(nèi)注射之間沒有統(tǒng)計學上的顯著性(在5%水平)差異。
[0277] 實施例11:動物疾病模型-對照試驗
[0278] 進行實驗來開展小鼠尾部剪裁測定，從而表征?￥111^17)-/-、？1乂-/-〇^11冊， Blood. 1997;90:3962-6)和野生型C57BI/6小鼠中的出血參數(shù)以及它們對凝血因子制品的 反應。
[0279] 測試的凝血因子制品是Advah;k和:ImniUnine?。Advate18^1^!!!制品（巴克斯特 公司，奧地利）。]mmunine K是提純的血楽制品（巴克斯特公司，奧地利）。
[0280]按照在【具體實施方式】中描述的方法，在尾部剪裁以后，在尾部剪裁測定中監(jiān)控失 血62分鐘。FVIII-/-小鼠被用rFVIIKAcbate?)以25、50或100U/kg靜脈內(nèi)注射或者單獨用 載體給藥。載體是Advate劑型緩沖液，其為38mg/ml甘露醇、10mg/ml海藻糖、108mEq/L鈉、 12mM組氨酸、12mM Tr i s、1 · 9mM鈣、0 · 17mg/ml聚山梨酸酯-80、0 · lmg/ml谷胱甘肽。作為對 照，C57BI/6小鼠被單獨給藥載體。給藥rFVII I導致在整個62分鐘期間依賴劑量的失血減 少。實驗的存活數(shù)據(jù)被顯示于下表中。
[0281] 表24:在尾部剪裁實驗中用Advate&FVII I處理的FVIII-/-小鼠的存活率
[0283] /1:川丨mmunincK Ι_?Χ以50、100或2001]/1^靜脈內(nèi)注射或者單獨用載體給藥的 FIX-/-小鼠的尾部剪裁后，監(jiān)控失血62分鐘。作為對照，C57BI/6小鼠被單獨給藥載體。給藥 FIX導致在整個62分鐘期間依賴劑量的失血減少。實驗的存活數(shù)據(jù)被顯示于下表中。
[0284] 表25:在尾部剪裁實驗中用丨mmunineKl_'IX-/-處理的FIX-/-小鼠的存活率
[0286] 數(shù)據(jù)顯示，在FVIII-/-模型中，25-100U/kg的Advai^ FVIII劑量依賴性地改進了 出血參數(shù)和存活率。在FIX-/-模型中，50-200U/kg的Imminii丨icK;FIX劑量依賴性地改進了出 血參數(shù)和存活率。因此，F(xiàn)VIII-/-模型是用于測試先導化合物的凝血FVIII活性的合適的模 型。FIX-/-模型是用于測試化合物的凝血FIX活性的合適的模型。
[0287] 實施例12:動物疾病模型-A01的效力
[0288] 在【具體實施方式】中描述的尾部剪裁模型中測試被給藥的A01對出血參數(shù)和 FVIII-/-小鼠的存活率的影響。在FIX-/-小鼠中進行類似的實驗。
[0289] 在尾部剪裁之前五分鐘靜脈內(nèi)注射給藥20mg/kg的A01的8雄8雌FVIII-/-小鼠組 的尾部剪裁后的失血平均體積在大多數(shù)時間點與單獨給藥載體的對照組小鼠的失血的平 均體積相比顯著地不同（P〈〇. 05)。載體是用于注射的水中5%二甲亞砜、5 %Cremopnor EL、 0.05%吐溫80。在尾部剪裁后52分鐘和62分鐘，差異是顯著的，p〈0.01。數(shù)據(jù)如圖2和下表所 示。用于在該實驗中相比較的小鼠殘存曲線的對數(shù)秩檢驗顯示，A01 20mg/kg靜脈內(nèi)注射的 存活率統(tǒng)計上顯著地比載體對照的存活率長(p值=〇. 0028)。
[0290] 表26:在尾部剪裁實驗中用A01處理的FVIII-/-小鼠的存活率
[0292] 重復上述實驗，以便提供其再現(xiàn)性的指示。結(jié)果顯示于下表中。盡管在這兩個獨立 進行的實驗內(nèi)觀察到變化，但用A01處理的動物出血較少并且存活更長。
[0293] 表27:在尾部剪裁實驗中用A01處理的FVIII-/-小鼠的存活率
[0295] 通過使用相同的模型，得到了進一步的數(shù)據(jù)，雖然尾部剪裁是1厘米而非0.5厘米， 并且小鼠根據(jù)性別被分組。試劑經(jīng)靜脈內(nèi)注射給藥。在該實驗中，顯然A01在雌性小鼠中比 在雄性小鼠中更有效。結(jié)果顯示于下表中。
[0296] 表28:在尾部剪斷實驗中在FVIII-/-小鼠中A01的性別影響
[0298] 各組含有相同數(shù)量的雄性和雌性小鼠，除非另有說明。
[0299] 在尾部剪裁之前五分鐘靜脈內(nèi)注射給藥20mg/kg的A01的16只FIX-/-小鼠組的尾 部剪裁后的失血平均體積在任何時間點都與單獨給藥載體的對照組小鼠的失血的平均體 積相比并沒有顯著不同（P〈〇. 05)。在給藥AO 1的小鼠存活率和單獨給藥載體的小鼠存活率 方面沒有顯著差異。
[0300] 這些結(jié)果證明，A01能夠通過降低失血并提高在尾部剪裁后的存活率而至少部分 地彌補在FVIII-/-小鼠中FVIII的不足，但是在FIX-/-小鼠中沒有效果。AO 1被認為是最優(yōu) 選的肽，因為其已經(jīng)在血友病模型中顯示了效力。
[0301 ]實施例13:在FVII I-/-小鼠尾部剪裁模型中化合物測試的結(jié)果
[0302]通過在FVII I-/-尾部剪裁模型中腹腔注射給藥，采用0.5厘米尾部剪裁，進一步測 試A01。數(shù)據(jù)總結(jié)于下表中。
[0303] 表29:在尾部剪裁實驗中用A01處理的FVIII-/-小鼠的存活率
[0305]與用載體10ml/kg腹腔注射給藥的雌性小鼠相比，用A01 20mg/kg給藥的雌性小鼠 具有統(tǒng)計上顯著更長的存活率（5%水平）（兩側(cè)的p值p = 0.0073;對數(shù)秩檢驗）。在用A01 20mg/kg腹腔注射給藥的雄性小鼠的存活曲線與用載體10ml/kg腹腔注射給藥的雄性小鼠 的存活曲線之間沒有統(tǒng)計上顯著的差異(5%的水平）。在該實驗中，在對照組中的雄性似乎 存活得比在對照組中的雌性更好。
[0306]實施例14:表征先導化合物的實驗總結(jié)
[0307] 下面的化合物在限定內(nèi)在凝血酶產(chǎn)生測定中具有活性:A01、A03、A05、A19、B01、 △02、803、805、806、厶06、厶20、厶07、厶08、厶09和807。其中403、厶02、803、厶08和厶09在10(^]\1處具 有至少1200mU/mL FEIBA的凝血酶產(chǎn)生活性。
[0308]下面的化合物在限定二元路徑凝血酶產(chǎn)生測定中具有活性:A02、A03、A08、A09、 A18、B03、B04、A07、A15、A06和A17。其中，A09在50μM處具有至少10mU/mLFEIBA的峰值IIa活 性。B03、B04和A15在50或100μΜ處具有至少10mU/mL FEIBA的峰值Ila活性。
[0309] 下面的化合物在限定纖維蛋白沉積測定中具有活性:401、801)05、803306和 A07〇
[0310] 下面的化合物在人類血漿中保溫30分鐘后具有至少50%的穩(wěn)定性:A01、A19、A07、 A20、A06、A02、A03、A08、A09、B07、B06、B05和A05。
[0311] 下面的化合物在TOS pH 7.4中具有至少25以]?的溶解度:409、803、807、806、805、 △07、厶20、厶06、厶02、厶03和厶16。其中，803、807、805、厶07、厶20、厶06、厶03和厶16在卩85?!17.4中 具有至少1〇〇μΜ的溶解度。
[0312] A01、A05和A16被鑒定為低效價的HERG-通道阻斷劑。
[0313] A01被鑒定在FVIII-/-小鼠中在尾部剪裁測定中具有活性。
[0314] 實施例15:在一個成年受試人類個體中的甲型血友病治療
[0315] 在大劑量FVIII治療后，甲型血友病病人發(fā)展針對FVIII的同種抗體抑制劑是有代 表性的。在典型的方案中，臨床醫(yī)生監(jiān)控在由病人血漿制備的血清中這樣的抗體的存在。當 抗體反應的滴度不期望地變高、比如高約5BU時，臨床醫(yī)生可以決定停止在病人體內(nèi)注入 FVIII，并且開始給藥本發(fā)明的肽比如肽A01。
[0316]肽可以按照US 5,439,686中描述的方法而被配制為在白蛋白殼中直徑約ΙΟμΜ的 微粒，懸浮于水介質(zhì)中。病人可以通過使用噴霧器吸入而自我給藥該劑型?？梢晕朊咳栈?者每日兩次的5或10mg劑量。臨床醫(yī)生可以在開始肽治療之后不久測試部分促凝血酶原激 酶時間，以便確認效力。取決于結(jié)果，劑量能夠相應地被改變。如果有必要實質(zhì)上提高劑量， 能夠使用更小的微粒，典型地為約5μΜ直徑，并且它們能夠被靜脈內(nèi)給藥。
【主權(quán)項】
1. 一種肽或者肽衍生物，其包含： (i) 氨基酸序列，其包含imfwydcye;或 (ii) 變體氨基酸序列，其包含在imfwydcye中的一個、兩個、三個、四個、五個或六個氨 基酸取代， 其中，所述肽或者肽衍生物具有促凝血活性。2. 如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，包含： (i) 氨基酸序列，其包含cimfwydcye;或 (ii) 變體氨基酸序列，其包含在cimfwydcye中的一個、兩個、三個或四個、五個、六個或 七個氨基酸取代。3. 如權(quán)利要求1或2所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，所述變體氨基酸序列包含一 種氨基酸序列，其包含乂1乂2乂3乂4乂以6乂7乂8乂9乂1()，其中乂1，當存在時，是(3、8、7、10-?611、(：3、0-Nva、D_Nle或k; X2是i、y、w或d; X3是c或m; X4是f、t、v或c; X5是w或c; X6是y或c; X7是d、e或f; X8 是c、e、f、y 或d; Xg是y 或w; Χ?ο是e或 i。4. 如權(quán)利要求3所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，所述變體氨基酸序列包含一種氨 基酸序列，其包含XihLXwydXsye，其中，Χι是c、C、D_Pen或s; X2是i、y或w; X3是c或m; X4是f、 t、或v;X8是c或e〇5. 如權(quán)利要求1-4中任一項所述的肽衍生物，其特征在于，其在N-端處被乙?；?、在C-端處被酰胺化，并且/或者在兩個末端之一處被PEG化。6. 如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，其為環(huán)狀。7. 如權(quán)利要求1所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，包含、或者由如下組成： Ac-cimfwydeye-NH2, 二硫化-二聚(Ac-cimfwydeye_NH2)2， Ac-TTDS-(cymfwydc)-ye~NH2, K-TTDS-(cymfwydc)-ye_NH2， Ac-cimtwydcye-NH2, Ac-cimvwydcye-NH2, cymfwydcye, Ac-(cymfwydc)-yeG_NH2， Ac-(D-Pen)imfwydeye-NH2, 0 (CH2-CH2-〇-CH2-C〇-imf wydey e-NH2) 2, P比啶 _3，5- (CO-imf wydeye_NH2) 2， H2N-E-TTDS-(cymfwydc)-ye_NH2， Ac-(cymfwydc)-yeK, Ac-(cymfwydc)-ye-TTDS-K, Ac-simfwydeye-NH2, Ac-simfwydeye-NH2, Ac-ydmcwcefyi-NH2, Ac-idmccyfywe-NH2, Ac-cimfwyddye-NH2, Ac-(cymfwydc)-ye, Ac-(cymfwydc)-ye-TTDS_NH2， Ac-TTDS-(cymfwydc)-ye-TTDS-NH2, K-(cymfwydc)-ye~NH2, Ac_K_(cymfwydc)-ye_NH2， E-(cymfwydc)-ye~NH2, Ac-K-TTDS-(cymfwydc)-ye_NH2， Ac-(cymfwydc)-yeK_NH2， Ac-(cymfwydc)-ye-TTDS-K_NH2， Ac-(cymfwydc)-ye-TTDS-E_NH2， Ac-timfwydeye-NH2, Ac-(c imfwydc)-ye_NH2， Ac-(cymfwydc)-ye_NH2， Ac-(cwmfwydc)-ye_NH2， Ac-cicfwydcye-NH2, Ac-(D-Nva)imfwydeye-NH2, Ac-(D~Nle)imfwydeye-NH2, Ac-(Cys)imfwydeye-NH2, (cymfwydc)-ye~NH2, TTDS-(cymfwydc)-ye-TTDS-NH2? Ac-kimfwydeye-NH2, 其中，-TTDS-是4,7，10-三氧雜-1，13-十三烷二胺、（D-Pen)是D-青霉胺、（D-Nva)是D-正纈氨酸、(D-Nle)是D-正亮氨酸。8. 如權(quán)利要求1-7中任一項所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，其分子量在0.5至 3.5kD之間。9. 一種二元肽，其包含如權(quán)利要求1-8中任一項所限定的第一種肽或者第一種肽衍生 物，所述第一種肽或者第一種肽衍生物結(jié)合于如權(quán)利要求1-8中任一項所限定的第二種肽 或者第二種肽衍生物，其中，所述第一種肽或者第一種肽衍生物可以與所述第二種肽或者 第二種肽衍生物相同或者不同，以及其中所述二元肽具有促凝血活性。10. 如權(quán)利要求1-8中任一項所述的肽或者肽衍生物或者如權(quán)利要求9所述的二元肽， 其特征在于，所述促凝血活性是25、50或100μΜ的肽、肽衍生物或者二元肽的凝血酶產(chǎn)生時 間，相當于在限定內(nèi)在凝血酶產(chǎn)生測定中至少100mU/mL因子八抑制物旁路活性(FEIBA)、優(yōu) 選至少300mU/mL FEIBA、更優(yōu)選至少900mU/mL FEIBA、最優(yōu)選至少1200mU/mL FEIBA的促凝 血活性。11. 如權(quán)利要求1-8中任一項所述的肽或者肽衍生物或者如權(quán)利要求9所述的二元肽， 其特征在于，所述促凝血活性是在限定內(nèi)在凝血酶產(chǎn)生測定中，25、50或100μΜ的肽、肽衍生 物或者二元肽在30分鐘內(nèi)、優(yōu)選在15分鐘內(nèi)、最優(yōu)選在10分鐘內(nèi)出現(xiàn)峰值的凝血酶產(chǎn)生時 間。12. 如權(quán)利要求1-8中任一項所述的肽或者肽衍生物或者如權(quán)利要求9所述的二元肽， 其特征在于，當給藥于重型人甲型血友病動物模型中時，其能夠至少部分地彌補生物活性 FVIII的缺失。13. 如權(quán)利要求1-8中任一項所述的肽或者肽衍生物或者如權(quán)利要求9所述的二元肽， 其特征在于，其在人類血漿中在30分鐘時的穩(wěn)定性是至少50%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少 80%、最優(yōu)選至少90 %。14. 如權(quán)利要求1-8中任一項所述的肽或者肽衍生物或者如權(quán)利要求9所述的二元肽， 其特征在于，其在磷酸鹽緩沖鹽水pH 7.4中的水溶性是至少25μΜ、優(yōu)選至少60μΜ、最優(yōu)選至 少100μΜ〇15. -種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1-8中任一項所述的肽或者肽衍生物和一種以 上藥學可接受的賦形劑、載體和/或稀釋劑。16. 如權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其特征在于，其適合于皮下注射、鼻腔、口腔、口 服或肺部給藥。17. 如權(quán)利要求15所述的藥物組合物，其特征在于，其適合于靜脈注射給藥。18. -種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求9所述的二元肽和一種以上藥學可接受的賦形 劑、載體和/或稀釋劑。19. 如權(quán)利要求1-8中任一項所述的肽或者肽衍生物用于藥物的應用。20. 如權(quán)利要求9所述的二元肽用于藥物的應用。21. 如權(quán)利要求1-8中任一項所述的肽或者肽衍生物用于治療FV、FVII、FVIII、FX和/或 FXI不足的病人。22. 如權(quán)利要求9所述的二元肽用于治療?￥、？￥11、？￥111、？乂和/或?乂1不足的病人。23. 如權(quán)利要求1-8中任一項所述的肽或者肽衍生物在藥物制造中的應用，所述藥物用 于?￥、？￥11?。?11小乂和/或?乂1不足的治療。24. 如權(quán)利要求9所述的二元肽在藥物制造中的應用，所述藥物用于FV、FVII、FVIII、FX 和/或FXI不足的治療。25. 如權(quán)利要求21所述的肽或者肽衍生物，其特征在于，所述病人具有抗FV、FVII、 FVIII、FX和/或FXI的抑制劑抗體。26. 如權(quán)利要求23或24所述的應用，其特征在于，所述病人具有抗FV、FVII、FVIII、FX 和/或FXI的抑制劑抗體。27. 如權(quán)利要求22所述的二元肽，其特征在于，所述病人具有抗FV、FVII、FVIII、FX和/ 或FXI的抑制劑抗體。28. -種通過固相合成制備如權(quán)利要求1-8中任一項所述的肽或者肽衍生物的方法。
【專利摘要】一種肽或者肽衍生物，其包含：(i)WDLYFEIVW(SEQ？ID？NO：1)；或(ii)變體氨基酸序列，其包含在WDLYFEIVW(SEQ？ID？NO：1)中的一個、兩個、三個或四個L-氨基酸取代；或(iii)所述(i)部分和(ii)部分之一的肽或者肽衍生物的反倒型變體，其中所述肽或者肽衍生物具有促凝血活性。一種肽或者肽衍生物，其包含：(i)氨基酸序列，其包含imfwydcye；或(ii)變體氨基酸序列，其包含在imfwydcye中的一個、兩個、三個或四個、五個或六個氨基酸取代，其中所述肽或者肽衍生物具有促凝血活性。
【IPC分類】C07K14/755, C07K1/04, A61P7/04, A61K38/17
【公開號】CN105524163
【申請?zhí)枴緾N201610040575
【發(fā)明人】弗里德里希·沙伊夫林格, 米夏埃爾·道卡爾
【申請人】巴克斯艾爾塔公司, 巴克斯艾爾塔股份有限公司
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2009年4月16日
【公告號】CA2721694A1, CN102007140A, CN102007140B, EP2279200A1, EP2279200B1, US8563688, US8822638, US9206234, US20100022445, US20120077749, US20150038676, US20160060295, WO2009137256A1