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      生物活性肽的制作方法_4

      文檔序號:9761917閱讀:來源:國知局
      生的偏酯的縮合產(chǎn)物 比如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸酯、或環(huán)氧乙烷與由脂肪酸和己糖醇酸酐衍生的偏酯的縮 合產(chǎn)物比如聚乙烯單油酸山梨醇酐酯)。水懸浮液還可以包含一種以上防腐劑,例如對羥基 苯甲酸乙酯或正丙酯、一種以上著色劑、一種以上增味劑、以及一種以上甜味劑比如蔗糖或 者糖精。
      [0145]肽或者肽衍生物可以配制成局部給藥或者表面給藥,比如局部施用至皮膚、創(chuàng)口 或者粘膜,比如在眼睛中給藥。用于局部給藥的劑型典型地包含局部載體與活性試劑相組 合,有或者沒有附加的任選成分。合適的局部載體和附加成分為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知,并 且顯然,載體的選擇將取決于特定的物理形式和釋藥模式。局部載體包括:水;有機(jī)溶劑比 如醇類(例如,乙醇或異丙醇)或甘油;二元醇(例如,丁二醇、異戊二醇或丙二醇);脂族醇 (例如,羊毛脂);水和有機(jī)溶劑的混合物、以及有機(jī)溶劑比如醇類和甘油的混合物;脂質(zhì)基 材料比如脂肪酸、甘油酯(包括油類,比如礦物油、以及天然或者合成來源的脂肪)、磷酸甘 油酯、鞘脂類和蠟;蛋白質(zhì)基材料比如膠原和明膠;硅酮基材料(非易失性的和揮發(fā)性的)以 及基于碳?xì)浠衔锏牟牧媳热缥⒑>d和聚合物基質(zhì)。組合物可以進(jìn)一步包括一種以上適合 于改進(jìn)所應(yīng)用劑型的穩(wěn)定性或效果的成分,比如穩(wěn)定劑、懸浮劑、乳化劑、粘度調(diào)節(jié)劑、膠凝 劑、防腐劑、抗氧化劑、皮膚滲透性增強(qiáng)劑、潤濕劑和緩釋材料。這樣的成分的例子在 Martindale-The Extra Pharmacopoeia(藥學(xué)出版社,倫敦 1993)和 Martin(編), Remington's Pharmaceutical Sciences中有描述。劑型可以包含微膠囊,比如輕甲基纖維 素微膠囊或明膠微膠囊、脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳劑、納米顆?;蚣{米膠囊劑。
      [0146] 藥物組合物可以被配制為吸入劑型,包括噴霧劑、合劑、或氣霧劑。對于吸入劑型, 在此提供的化合物可以經(jīng)由任何已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的吸入方法釋放。這些吸入方 法和裝置包括,但不限于,具有推進(jìn)劑比如CFC或HFA或者生理學(xué)可接受并且環(huán)境可接受的 的推進(jìn)劑的計(jì)量式藥劑吸入器。其他合適的裝置是呼吸操縱吸入器、多劑量干粉吸入器和 氣霧劑噴霧器。用于主題方法的氣霧劑劑型典型地包括推進(jìn)劑、表面活性劑和共溶劑,并且 可以被填入普通的被合適的計(jì)量閥封閉的噴霧劑容器中。
      [0147] 吸入劑組合物可以包含含有適合于霧化和支氣管內(nèi)使用的活性成分的液體組合 物或粉末組合物、或者經(jīng)由氣溶膠單位分配性計(jì)量的藥劑給藥的氣霧劑組合物。合適的液 體組合物包含在水、藥學(xué)可接受的吸入劑溶劑例如等滲鹽水或抑菌水中的活性成分。溶液 通過利用栗或擠壓驅(qū)動霧化的噴霧分配器、或者通過任何其他的傳統(tǒng)方法而被給藥,所述 傳統(tǒng)方法用于引起或者使必需劑量含量的液體組合物能夠被吸進(jìn)病人的肺中。其中載體是 液體的用于給藥的合適劑型,例如鼻噴入劑型或滴鼻劑,包括活性成分的水溶液或油質(zhì)溶 液。
      [0148] 適用于鼻腔給藥的其中載體是固體的劑型或組合物包括粗粉,所述粗粉的顆粒尺 寸是例如在20至500微米范圍內(nèi),其以鼻吸藥給藥的方式被給藥(即,通過從緊貼鼻子的粉 末容器經(jīng)過鼻部通道快速吸入)。舉例來說,合適的粉末組合物包括活性成分的粉末制品, 所述活性成分與乳糖或其他適用于支氣管內(nèi)給藥的惰性粉末充分混合。該粉末組合物能夠 經(jīng)由氣溶膠分配器或者包裹入易破的膠囊給藥,所述膠囊可以被病人插入可刺穿包膜并且 以適合于吸入的穩(wěn)定氣流將粉末吹出的裝置中。
      [0149] 藥物組合物可以被配制為持續(xù)釋放劑型(即,在給藥后影響調(diào)節(jié)劑緩釋的劑型比 如膠囊)。這樣的劑型一般可以通過使用眾所周知的技術(shù)制備,并且通過例如口服、直腸或 皮下注射植入、或者通過在期望靶位點(diǎn)處植入而給藥。用于在這樣的劑型內(nèi)部使用的載體 是生物相容的,并且還可以是可生物降解的;優(yōu)選該劑型提供一種相對恒定水平的調(diào)節(jié)劑 釋放。包含在持續(xù)釋放劑型內(nèi)部的調(diào)節(jié)劑含量取決于例如植入的位點(diǎn)、釋放速度和預(yù)期持 續(xù)以及待被治療或預(yù)防的狀況的性質(zhì)。
      [0150] 藥物組合物可以用提高生物利用率的試劑比如有機(jī)溶劑配制。例如,Cremophor EL'、(產(chǎn)品編號〇〇647/l/63;BASF公司,Aktiengesellschaft,德國)是聚乙氧基蓖麻油,其 通過使35摩爾的環(huán)氧乙烷與每摩爾的蓖麻油反應(yīng)而制備。其可以用于穩(wěn)定在含水體系中非 極性材料的乳化液。作為另一種選擇,肽、肽衍生物或者二元肽可以被合并入或者結(jié)合于蛋 白質(zhì)微顆粒或者納米顆粒,用于改進(jìn)生物利用率。合適的微顆粒和納米顆粒在US 5,439, 686(Desai等;Vivorx制藥公司,加利福尼亞州)和US 5,498,421 (Grinstaff等;Vivorx制藥 公司,加利福尼亞州)中有描述。適當(dāng)?shù)?,蛋白質(zhì)納米顆粒包含人血清白蛋白、尤其是人血清 白蛋白或其重組體形式。wo 2007/077561(Gabbai ;D〇-Coop技術(shù)有限公司,以色列)描述了 另一種合適的載體,其包含納米結(jié)構(gòu)和液體,稱為Neowater?。
      [0151] 為了口服給藥和腸胃外給藥予病人包括人類病人,本發(fā)明的肽、肽衍生物或者二 元肽以單個(gè)劑量或分批劑量給藥的每天劑量水平通常是每成年人2至2000mg(即,大約0.03 至30mg/kg)。
      [0152]因此,例如,本發(fā)明的肽、肽衍生物或者二元肽的藥片或膠囊可以含有2mg到 2000mg的活性化合物用于單次、或在某時(shí)兩次以上地給藥,視情況而定。無論如何醫(yī)師將確 定最適合于任何單個(gè)病人的實(shí)際劑量,并且將隨年齡、重量和特定病人的反應(yīng)而變。上述劑 量是平均情況的示例。當(dāng)然可能會有個(gè)別的情況,其中更高或更低劑量范圍是有益的,并且 這都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
      [0153] 因?yàn)楂F用,本發(fā)明的肽、肽衍生物或者二元肽根據(jù)正常的獸醫(yī)實(shí)踐作為可適合接 受的劑型被給藥,并且獸醫(yī)將確定最適合于特定動物的給藥方案和給藥途徑。
      [0154] 在此公開的肽、肽衍生物和二元肽可以用于藥物應(yīng)用和畜牧業(yè)或者獸醫(yī)應(yīng)用。典 型地,該產(chǎn)品用于人類。術(shù)語"病人"表示哺乳動物個(gè)體,并且在說明書全文和權(quán)利要求中如 此使用。
      [0155] 本發(fā)明的第五個(gè)方面提供了一種本發(fā)明第一個(gè)方面或第二個(gè)方面的肽或者肽衍 生物、或者本發(fā)明第三個(gè)方面的二元肽用于治療?¥、?¥11、?¥111、?乂和/或?乂1不足的病人的 應(yīng)用。
      [0156] 本發(fā)明的第六個(gè)方面提供了一種本發(fā)明第一個(gè)方面或第二個(gè)方面的肽或者肽衍 生物、或者本發(fā)明第三個(gè)方面的二元肽在藥物制造中的應(yīng)用,所述藥物用于治療在病人中 FV、FVII、FVI1I、FX和/或 FXI不足。
      [0157] 本發(fā)明的第七個(gè)方面提供一種治療具有?¥、?¥11、?¥111、?乂和/或?乂1不足的病人 的方法,包括給藥治療有效量的第四個(gè)方面的藥物組合物。
      [0158] 本發(fā)明的肽、肽衍生物和二元肽可以用于治療?¥?。?1、?¥111、?乂和/或?乂1不足, 既用于預(yù)防、也用于治療急性出血。FVIII缺乏(甲型血友?。┑牟∪私?jīng)常發(fā)展FVIII的抑制 劑抗體。(FIX的)抑制劑發(fā)展在FIX缺乏(血友病B)中也是已知的。因?yàn)镕V、FVII、FXI和FX不 足是非常稀有的先天性紊亂,很少知道抑制劑發(fā)展,雖然具有這些紊亂的病人或許可以發(fā) 展抑制劑是可行的。抑制劑病人的治療是第五、第六和第七方面的優(yōu)選實(shí)施方式。這些抑制 劑病人可以具有或者大于5BU的高滴度反應(yīng)或者在0.5和5BU之間的低滴度反應(yīng)。典型地,該 抑制劑是直接對抗FVIII的,并且病人具有甲型血友病。
      [0159] 對FVIII的抗體反應(yīng)等級能夠通過使用功能性抑制劑測定法被定量,比如在下述 中有描述:[0]Kasper CK等(1975)會議論文集:一種更均一的因子VIII抑制劑測量法。 Thromb Diath Haemorrh 34(2):612。?乂1抑制劑可能按照Kasper描述的方法通過aPTT測定 而被定量。FV、FVII和FX的抑制劑可能按照Kasper所述的程序通過基于PT的測定而被定量。
      [0160] 根據(jù)本發(fā)明的第八、第九或第十個(gè)方面的肽或者肽衍生物不是FVIII或其片段。典 型地,其不包含任何FVIII蛋白的氨基酸序列或者由其組成,不論是否是人類、哺乳動物或 脊椎動物來源。也不包含F(xiàn)VIII蛋白的片段。典型地,其包含F(xiàn)VIII蛋白比如人類FVIII蛋白 中少于50個(gè)、少于20個(gè)、少于10個(gè)、少于5個(gè)連續(xù)的氨基酸。優(yōu)選的肽和肽衍生物是本發(fā)明第 一個(gè)方面和第二個(gè)方面的肽和肽衍生物、或者本發(fā)明第三個(gè)方面的二元肽。可替代的肽和 肽衍生物可以按照與例舉的肽和肽衍生物有關(guān)的描述的方法被人工合成和測試促凝血活 性。
      [0161] 本發(fā)明第八、第九或第十個(gè)方面的肽和肽衍生物可以被配制為藥物組合物,如上 所述,并且可以被用于如上所述的藥物中。
      [0162] 以下用實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明,但并不是對本發(fā)明作任何限制。
      [0163] 實(shí)施例1:具有凝血酶產(chǎn)生活性的化合物的合成和鑒定
      [0164] 通過使用"限定內(nèi)在凝血酶產(chǎn)生測定"篩選化合物,其中凝血酶產(chǎn)生在因子XIa和 磷脂囊泡存在的條件下在FVIII被抑制的人血漿中被體外定量。按照【具體實(shí)施方式】中描述 的方法,在上述測定中、以及在使用組織因子和磷脂代替因子XIa和磷脂的"限定二元路徑 凝血酶產(chǎn)生測定"中篩選別的化合物。
      [0165] 肽和肽衍生物類化合物通過標(biāo)準(zhǔn)的固相肽合成或SPOT合成以50-100nm〇l肽每斑 點(diǎn)被人工合成,該合成法允許可設(shè)定位置地在連續(xù)的纖維素膜上化學(xué)合成肽。將肽溶于 10%或50%二甲亞砜水溶液中。
      [0166] 按如下所述進(jìn)行肽和肽衍生物的PEG化。在溶液中將PEG5000NHS-酯偶聯(lián)于經(jīng)高效 液體色譜提純的肽的N-端。如果賴氨酸存在于該肽序列中,該氨基酸被用ivDde保護(hù)基保護(hù) 起來以便避免在ε_氨基處PEG化。在PEG5000偶聯(lián)于N-端后,ivDde保護(hù)基被二甲基甲酰胺中 3 %水合肼解離,接著通過高效液體色譜再純化最終產(chǎn)品。
      [0167] 確定被認(rèn)為可促進(jìn)凝血酶產(chǎn)生的化合物,如表7和8中所示。
      [0168] 表7:以A01為基礎(chǔ)的化合物
      [0170] 在上述各表中,0-是4,7,10-三氧雜-1,13-十三烷二胺(ttds)
      [0171] 表8:以B01為基礎(chǔ)的化合物
      [0173]~在上述各表中,-0-是4,7,10-三氧雜-1,13-十三烷二胺(ttds)。在該研究中使用 的命名為B01、B02、B05和B06的實(shí)際的肽是環(huán)狀的。
      [0174] 實(shí)施例2:在內(nèi)在路徑凝血酶產(chǎn)生測定和二元路徑凝血酶產(chǎn)生測定中的化合物測 試
      [0175] 不同濃度的每種肽在使用人類FVIII被抑制的血漿的限定內(nèi)在凝血酶產(chǎn)生測定中 被測試。結(jié)果提供于下表中。
      [0176] 表9:在限定內(nèi)在凝血酶產(chǎn)生測定(被FXIa引發(fā))中肽化合物的活性。給出凝血酶成 峰時(shí)段,作為基于FEIBA標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線計(jì)算的FEIBA當(dāng)量活性(mU/mL)。
      [0178] 基于Z-GGR-AMC裂解以釋放熒光團(tuán)AMC的體外凝血酶產(chǎn)生測定通過使用正常人血 漿被開發(fā),即限定二元路徑凝血酶產(chǎn)生測定。峰值凝血酶產(chǎn)生的組織因子依賴性和凝血酶 成峰時(shí)段在含有固定濃度磷脂(即3.2μΜ)的組合物中被表征。磷脂依賴性在含有固定濃度 組織因子(即7.2ρΜ)的組合物中被表征。成峰時(shí)段(到達(dá)凝血酶產(chǎn)生峰值的時(shí)間)取決于磷 脂或組織因子的濃度。該測定的最后版本如同在【具體實(shí)施方式】中描述的那樣,其中l(wèi)〇yL含 有(32μΜ磷脂和71.6pM組織因子)的試劑C高以1 OOyL的總體積被使用。
      [0179] 通過使用3.2μΜ磷脂和7.2pM組織因子在FVIII缺乏或受抑制的血漿中進(jìn)行進(jìn)一步 的研究,以便表征各種凝血因子制品對峰值凝血酶產(chǎn)生和凝血酶成峰時(shí)段的影響。這些研 究提供了一種基礎(chǔ),其可在測定中比較化合物的效力。簡言之,在FVIII缺乏的血漿中以0、 5、10、20、40和80mU/mL測試rFVIII(來自巴克斯特的 Recombinate? FVIII)。在FVIII受抑制 的血漿中以0、8、16、31、63和125mU/mL測試FEIBA。在FVIII受抑制的血漿中以0、0.1、0.4、 1.6、6.3和25nM測試FVIIa。結(jié)果如圖1所示。對于在FVIII缺乏的血漿中的重組FVII I (Recombinate14)和對于在FVIII免疫抑制的血漿中的FEIBA和FVIIa,觀察到凝血酶產(chǎn)生參 數(shù)的濃度依賴性提高。峰值凝血酶提高了,并且延遲時(shí)間和凝血酶成峰時(shí)段降低了。
      [0180] 在這種使用試劑C高(Technoclone)用于引發(fā)凝血酶產(chǎn)生的限定二元路徑凝血酶 產(chǎn)生測定(DDPTGA)中測試化合物。結(jié)果提供于下表中。盡管該測定對于FVIII樣活性的敏感 性小于限定內(nèi)在凝血酶產(chǎn)生測定(DITGA),但數(shù)種化合物具有可檢測的活性。
      [0181] 表10:概括結(jié)果

      [0184] "峰值Ila"是在凝血酶產(chǎn)生曲線的峰值處產(chǎn)生的凝血酶含量。"成峰時(shí)段"是從凝 血酶產(chǎn)生反應(yīng)開始到產(chǎn)生最大含量時(shí)的時(shí)間。BLS =最低標(biāo)準(zhǔn)以下(below lowest standard)〇
      [0185] 在這些測定中甚至在沒有加入肽的情況下仍然會產(chǎn)生凝血酶。因此,如果峰值Ila 是在特定肽濃度下的"BLS",仍然會有凝血酶峰值,但是其低于被最低標(biāo)準(zhǔn)濃度取得的峰 值,該最低標(biāo)準(zhǔn)濃度是5mU/mL FVIII、8mU/mL FEIBA或O.lnM FVII。類似地,當(dāng)成峰時(shí)段是 "BLS"時(shí),所述到達(dá)峰值凝血酶產(chǎn)生的時(shí)間大于最低標(biāo)準(zhǔn)濃度取得的成峰時(shí)段。肽可能對成 峰時(shí)段而非峰值Ila具有顯著的影響,或者反之亦然。然而,優(yōu)選肽對成峰時(shí)段和峰值Ila都 有影響。B03、B04和A15積極地影響凝血酶產(chǎn)生的兩個(gè)方面。在一些肽的情況中,對凝血酶產(chǎn) 生的影響的濃度依賴性在高肽濃度下未被發(fā)現(xiàn),這或許可以通過非特異性的相互作用而被 解釋。
      [0186] 實(shí)施例3:在使用幾個(gè)減少型血漿的凝血酶產(chǎn)生測定中的化合物測試
      [0187] 以在【具體實(shí)施方式】中描述的裂解Z-GGR-AMC以便釋放熒光團(tuán)AMC為基礎(chǔ)的體外凝 血酶產(chǎn)生測定,即限定二元路徑凝血酶產(chǎn)生測定被用于表征在幾個(gè)減少型人血漿中化合物 的影響。在這些實(shí)驗(yàn)中,每個(gè)1〇〇μ1反應(yīng)含有l(wèi)〇yL試劑B,其包含磷脂囊泡磷脂酰膽堿/磷脂 酰絲氨酸80%/20 % (3.2μΜ)和17.9pM重組人組織因子。按照在【具體實(shí)施方式】中描述的方 法,使用1 OyL肽稀釋液、40yL TGA底物和40yL血漿。
      [0188] 在實(shí)驗(yàn)中使用的血漿被新鮮冷凍,并且因子V、因子VII/VIIa、因子VIII、因子X或 因子XL不足(George King Bio-Medical公司)。不足型血衆(zhòng)的殘留的凝血因子水平被限定 為小于1%。
      [0189] 對于在實(shí)驗(yàn)中使用的每個(gè)減少型血漿,在兩個(gè)濃度即50μΜ和80、90或100μΜ處測試 化合物。使用陰性對照,其中未包括受測化合物。結(jié)果總結(jié)于下表中。
      [0190] 表11:在各種減少型血漿中化合物對凝血酶產(chǎn)生的影響的概括結(jié)果
      [0192]刺激凝血酶產(chǎn)生:"+"意味著產(chǎn)生了刺激;意味著未刺激。在對照試驗(yàn)中,沒有 肽被包括。
      [0193]測試的所有減少型血漿顯示,在沒有肽的情況下沒有或者非常低的凝血酶產(chǎn)生, 這表明在使用的組織因子濃度下,所有凝血因子的相互作用對于凝血酶產(chǎn)生都是重要的。 數(shù)種肽在所有的酶原減少型血漿(FVII、FX或者FXI)中刺激了凝血酶產(chǎn)生,相反在FV減少的 血漿中凝血酶產(chǎn)生較低,這表明普通的路徑對于受肽刺激的凝血酶產(chǎn)生很重要。
      [0194]實(shí)施例4:在限定纖維蛋白沉積測定中化合物的活性
      [0195]按照在【具體實(shí)施方式】中描述的方法,在限定纖維蛋白沉積測定中測試各種肽刺激 纖維蛋白沉積的能力。結(jié)果顯示于下表中。
      [0196]表12:在限定纖維蛋白沉積測定中的化合物表征

      [0198] 所有的受測化合物都縮短了 FVIII被抑制的血漿的凝固時(shí)間和纖維蛋白形成。結(jié) 合凝血酶產(chǎn)生實(shí)驗(yàn),這證實(shí)了受測化合物的促凝血活性。大部分化合物以濃度依賴性方式 發(fā)揮了作用,雖然少數(shù)化合物在更高濃度下具有降低的活性,這可以歸因于非特異性相互 作用。
      [0199] 實(shí)施例5:用于化合物表征的體外測定
      [0200] 不僅在凝血酶產(chǎn)生測定中表征化合物的活性,而且表征其藥物動力學(xué)、溶解度、 HERG抑制和分子量。
      [0201 ] 藥物動力學(xué)(PK)研究
      [0202]峰研究被要求用于體內(nèi)效力研究的設(shè)計(jì)和解釋。血漿蛋白質(zhì)結(jié)合性、血漿穩(wěn)定性 和微粒體穩(wěn)定性全部被包括在范疇內(nèi)。
      [0203] 1.血漿蛋白結(jié)合性
      [0204] 在96孔微型平衡透析封閉系統(tǒng)(HDT-96;HTDialysis,LLC,Gales Ferry,康涅狄格 州)中確定化合物結(jié)合被稱作基質(zhì)的人血衆(zhòng)〇3;[(^6(31311^1:;[011,!1;^1^¥;[116,紐約州)、小鼠 血衆(zhòng)(Lampire Laboratory,Pipersvilie,賓夕法尼亞州)或小鼠血清白蛋白(Sigma,圣路 易斯市,密蘇里州)的程度。簡言之,該體系的每個(gè)單元包含被半透膜分開的供體腔室和受 體腔室。實(shí)驗(yàn)的原理是,蛋白質(zhì)(和與該蛋白質(zhì)結(jié)合的化合物)被保持在供體腔室中,并且不 能跨越薄膜。游離的化合物可能在兩個(gè)腔室之間經(jīng)由薄膜擴(kuò)散并且在實(shí)驗(yàn)期間達(dá)到平衡。 在這些實(shí)驗(yàn)中,半透膜由再生纖維素組成,并且具有12-14kD的分子量截流(目錄編號1101, HTDialysis,LLC)0
      [0205]購自Sigma的蛋白酶抑制劑混合物(P2714-1BTL)被包含于測定中,以便抑制受測 化合物的蛋白水解。其是蒸餾水中以50倍保藏液新近制備的。小鼠血清白蛋白是在磷酸鹽 緩沖鹽水(PBS)中新近制備的,濃度為40g/L。該P(yáng)BS購自Invitrogen(Carlsbad,加利
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