一種高效液相色譜反相鍵合相的超/亞臨界流體封端方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效液相色譜反相鍵合相的超/亞臨界流體封端方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 以C18為代表的高效反相液相色譜柱一直被描述為藥物發(fā)現(xiàn)、開發(fā)、方法驗(yàn)證 (validation)的心臟,高效反相液相色譜柱也極其廣泛地應(yīng)用在藥物代謝及動(dòng)力學(xué)、生命 科學(xué)、醫(yī)療健康、生物分析檢測、毒品和興奮劑檢測、食品安全分析、環(huán)境分析、軍事、國土安 全等領(lǐng)域。高效反相液相色譜制備柱也是最重要的分離純化技術(shù)之一。
[0003] 常規(guī)HPLC方法的開發(fā)幾乎總是從C18作為出發(fā)點(diǎn),反相色譜占了 80%以上的應(yīng) 用。無論是過去、現(xiàn)在還是可預(yù)見的未來,以球形B型硅膠為材料骨架的高效反相液相色譜 柱在實(shí)際應(yīng)用中一直占有統(tǒng)治地位。
[0004] 過去數(shù)十年來,無數(shù)努力集注于改善硅膠的品質(zhì)、優(yōu)化鍵合化學(xué)和封端技術(shù)。
[0005] 二十多年前,使用有機(jī)硅材料取代無機(jī)硅材料作為起始原料生產(chǎn)球形硅膠代表一 個(gè)劃時(shí)代的革命,生產(chǎn)的球形硅膠命名為B型球形硅膠。無機(jī)A型硅膠重金屬含量很高,硅 膠表面若干位置嚴(yán)重酸化及螯合效應(yīng)等導(dǎo)致許多堿性化合物回收率低。球形B型硅膠重金 屬含量很低,在非常大的程度上消除了 A型無機(jī)硅膠表面若干位置嚴(yán)重酸化及螯合效應(yīng)等 問題。用B型球形硅膠合成高效液相色譜填料,導(dǎo)致高效液相色譜柱產(chǎn)品質(zhì)量有質(zhì)的飛躍。
[0006] 十多年前,Waters公司首先引入市場的超高壓超高效UPLC技術(shù),使用小于2 ymB 型球形硅膠生產(chǎn)的UPLC超高效液相色譜柱,和Advanced Material公司首先引入市場的 1. 7 y m和2. 6 y m核殼硅膠型球形硅膠生產(chǎn)的UHPLC超高效液相色譜柱代表另一個(gè)劃時(shí)代 的革命。UPLC,UHPLC超高效液相色譜柱柱效是傳統(tǒng)5 y m的高效反相液相色譜柱的三至四 倍,因此使用短的5cm長度UPLC,UHPLC超高效液相色譜柱經(jīng)??梢缘竭_(dá)同5 y m25cm長度 的高效液相色譜柱同樣的效果,但分析時(shí)間縮短三至四倍,大大提高了分析速度。
[0007] 在鍵合化學(xué)上,過去數(shù)十年來除了優(yōu)化傳統(tǒng)的C18、C8、Phenyl鍵合化學(xué)外,最重 要的是Supelco公司首先引入市場的極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相。極性嵌入 式(Polar embedded)鍵合相是C18高效反相液相色譜〃衛(wèi)星群〃中最重要的產(chǎn)品,是C18 和C8鍵合相最重要的補(bǔ)充。極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相起源于Supelco ABZ。 Supelco ABZ的鍵合方法是用aminopropyl鍵合相和長鏈羧酸縮合反應(yīng)形成一個(gè)C16酰胺。 這個(gè)鍵合相對堿性化合物具有比較好的峰形,但很明顯是以犧牲酸性化合物和兩性化合物 峰形為代價(jià),因?yàn)閍minopropyl鍵合相的順 2功能團(tuán)不可能完全反應(yīng),鍵合相在酸性pH值 下表面電荷為正。需要說明的是,市場上一些C18就是使用攜帶正電荷的鍵合或封端試劑 生產(chǎn)的。從ABZ起頭,Supelco充分認(rèn)識(shí)到上述戰(zhàn)略的副作用,因此首先使用氨丙基硅烷合 成C16酰胺硅烷,然后鍵合到B型球形硅膠上,這就是Supelco著名的Discovery K: Amide。 由于沒有專利保護(hù),其他色譜廠商踴躍模仿,最終形成以酰胺或酰酯作為代表的極性嵌入 式(Polar embedded)鍵合相群。極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相的選擇性獨(dú)特,一 些在C18和C8鍵合相上困難的分離可能在極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相上得到很 好的解決。在相同條件下,合格的酰胺極性嵌入式鍵合相比相應(yīng)的C18鍵合相對堿性化合 物有更好的峰形,因?yàn)轷0泛蛪A性化合物有極性-極性(電荷轉(zhuǎn)移)的相互作用,客觀上部 分屏蔽了酸性硅醇基效應(yīng)。合格的酰胺極性嵌入式鍵合相能夠在100%水相條件下使用,而 且比所謂的水相C18穩(wěn)定得多。
[0008] 盡管取得了這些進(jìn)展,鍵合相封端問題沒有獲得很好的解決,一直是困擾色譜領(lǐng) 域最大的問題。迄今為止全部的嘗試只獲得有限的成功,鍵合相封端幾乎全部使用固-液 回流。事實(shí)上,不管什么樣的催化劑和封端試劑被使用,固-液回流下的封端是一個(gè)死胡 同。用同一廠商同一工藝生產(chǎn)的不同孔徑和不同粒徑的B型球形硅膠,用同一鍵合化學(xué)生 產(chǎn)的C18鍵合相最能夠體現(xiàn)這一點(diǎn)。一般來說,大孔硅膠C18鍵合相酸性硅醇基效應(yīng)(例 如300A C18)明顯小于相應(yīng)的中孔硅膠2〇〇A C18鍵合相,中孔硅膠200A C18鍵合相酸 性硅醇基效應(yīng)明顯小于相應(yīng)的小孔硅膠l()〇A C18鍵合相。此外,一般來說,同一孔徑B型 球形硅膠,用同一鍵合化學(xué)生產(chǎn)的C18鍵合相,10 ym粒徑鍵合相酸性硅醇基效應(yīng)明顯小于 5 y m粒徑鍵合相。5 y m粒徑鍵合相又明顯小于3 y m粒徑鍵合相,3 y m粒徑鍵合相粒徑鍵 合相又明顯小于1. 7 um粒徑鍵合相。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009] 研宄發(fā)現(xiàn),封端試劑在固-液回流狀態(tài)下很難擴(kuò)散到硅膠的一些小孔內(nèi)部,因此 無法封閉相應(yīng)的酸性硅醇基,色譜中體現(xiàn)為許多堿性化合物拖尾嚴(yán)重。球形硅膠是由二氧 化硅納米粒子聚合而成。小粒徑硅膠孔隙明顯小于大粒徑硅膠,封端試劑在固-液回流狀 態(tài)下很難擴(kuò)散到硅膠的一些小孔內(nèi)部,因此無法封閉相應(yīng)的酸性硅醇基。
[0010] 為了解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供了一種高效液相色譜反相鍵合相的超/亞臨 界流體封端方法,用于最大程度消除硅醇基的酸性效應(yīng)。從基礎(chǔ)科學(xué)的觀點(diǎn),超臨界流體封 端或亞臨界流體封端方法應(yīng)該是最終版本的封端技術(shù),因?yàn)樵诔R界流體或亞臨界流體狀 態(tài)下,擴(kuò)散系數(shù)是固-液回流狀態(tài)的1000倍,封端試劑能充分?jǐn)U散到硅膠的所有小孔內(nèi)部 而且通過化學(xué)反應(yīng)最大程度封閉活性硅醇基。理論上,這種方式幾乎是唯一的可行性。
[0011] 本發(fā)明提供的高效液相色譜反相鍵合相的超/亞臨界流體封端方法,是使用二氧 化碳超臨界流體和/或二氧化碳亞臨界流體作為載體將封端試劑和催化劑帶到裝有硅膠 反相鍵合相的超/亞臨界流體反應(yīng)器中,封閉條件下進(jìn)行封端反應(yīng)。
[0012] 本發(fā)明方法所述反相鍵合相覆蓋所有的反相和含反相機(jī)理的填料,包括但不限 于:單官能基團(tuán),二官能基團(tuán)和三官能基團(tuán)C18、C8、phenyl、hexyl-phenyl、C5、C4、C1、 PFPP,極性嵌入式(Polar embedded)鍵合相例如酰胺或酰酯,C3Q等。
[0013] 所述高效液相色譜反相鍵合相覆蓋所有硅膠或含硅膠的填料,包括但不限于:B 型球形硅膠、核殼硅膠、有機(jī)和無機(jī)混雜硅膠。
[0014] 所述封端試劑和催化劑可使用領(lǐng)域內(nèi)公開的試劑。例如,封端試劑包括但不限 于:1,1,3, 3, 5, 5-六甲基環(huán)三硅氮烷,八甲基環(huán)四硅氮烷,1,1,3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9-環(huán)五聚 二甲基硅氧烷,1,1,3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9, 11,11-十二甲基環(huán)己硅氧烷,1,1,3, 3, 5, 5-六苯基 環(huán)三硅氮烷,1,1,3, 3, 5, 5, 7, 7-八乙基環(huán)丁硅氨烷,1,1,3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9-十二乙基環(huán)戊 硅氧烷,1,1,3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9,11,11-十^乙基環(huán)己硅氧烷,^甲基^氣硅烷,^甲基^甲 氧基硅烷,三甲基氯硅烷,甲氧基三甲基硅烷,二甲基叔丁基氯硅烷,正丁基二甲基甲氧基 硅烷,N-丁基甲基二氯化硅,正丁基甲基二甲氧基硅烷,丁基三甲氧基硅烷,叔丁基三氯硅 烷,甲基三氯硅烷,甲基三甲氧基硅烷等和它們的聯(lián)合使用。催化劑包括但不限于N,0-雙 三甲基硅基乙酰胺,氨,三乙胺,1,1,1,3, 3, 3-六甲基二硅亞胺,N,N-二甲基三甲基硅胺等 和它們的聯(lián)合使用。
[0015] 優(yōu)選地,上述高效液相色譜反相鍵合相的超臨界流體封端方法中,所述封端反 應(yīng)時(shí)間為3~24小時(shí);所述封端反應(yīng)的壓力條件為50~600bar ;所述封端反應(yīng)溫度為 31. 2 ~200。。。
[0016] 優(yōu)選地,上述高效液相色譜反相鍵合相的超/亞臨界流體封端方法,還包括封端 反應(yīng)結(jié)束后冷卻的步驟,以及冷卻后釋放封端試劑和催化劑的步驟。
[0017] 優(yōu)選地,上述高效液相色譜反相鍵合相的超/亞臨界流體封端方法,釋放封端試 劑和催化劑后,還包括清洗封端反應(yīng)產(chǎn)物的步驟,以及干燥封端反應(yīng)產(chǎn)物的步驟。
[0018] 優(yōu)選地,上述高效液相色譜反相鍵合相的超/亞臨界流體封端方法中,所述的清 洗是將封端反應(yīng)