產(chǎn)物用乙腈，按1:1的體積比組成的甲醇和水混合液，丙酮依次進(jìn)行清洗。
[0019] 優(yōu)選地，上述高效液相色譜反相鍵合相的超/亞臨界流體封端方法中，所述的干 燥條件為80°c氮?dú)獗Ｗo(hù)。
[0020] 優(yōu)選地，上述高效液相色譜反相鍵合相的超/亞臨界流體封端方法中，所述的高 效液相色譜反相鍵合相為C18、C8、phenyl、hexyl-phenyl、C5、C4、Cl、PFPP、酰胺、酰酯或 C30鍵合相。
[0021] 所述高效液相色譜反相鍵合相覆蓋所有顆粒大小，包括但不限于：1. 2 ym， 10 u m，12 u m，15 u m，20 u m，40 u m，75 u m。
[0022] 所述高效液相色譜反相鍵合相覆蓋所有孔徑大小，包括但不限于：60人， 70A, 8〇A, 10〇A, ll〇A，12〇A, 13〇A, 1404 15〇A, 200A, 250A, 300A, 400A, 500A，1000A, 2000A和無(wú)孔。
[0023] 優(yōu)選地，上述高效液相色譜反相鍵合相的超/亞臨界流體封端方法，所述封端試 劑包括1，1，3, 3, 5, 5-六甲基環(huán)三硅氮烷、八甲基環(huán)四硅氮烷、1，1，3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9-環(huán)五 聚二甲基硅氧烷、1，1，3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9, 11，11-十二甲基環(huán)己硅氧烷、1，1，3, 3, 5, 5-六苯 基環(huán)三硅氮烷、1，1，3, 3, 5, 5, 7, 7-八乙基環(huán)丁硅氨烷、1，1，3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9-十二乙基環(huán) 戊硅氧烷、1，1，3, 3, 5, 5, 7, 7, 9, 9, 11，11-十二乙基環(huán)己硅氧烷、二甲基二氯硅烷、二甲基二 甲氧基硅烷、三甲基氯硅烷、甲氧基三甲基硅烷、二甲基叔丁基氯硅烷、正丁基二甲基甲氧 基硅烷、N- 丁基甲基二氯化硅、正丁基甲基二甲氧基硅烷、丁基三甲氧基硅烷、叔丁基三氯 硅烷、甲基三氯硅烷和甲基三甲氧基硅烷中的一種或幾種；所述催化劑包括N，0-雙三甲基 硅基乙酰胺、氨、三乙胺、1，1，1，3, 3, 3-六甲基二硅亞胺和N，N-二甲基三甲基硅胺中的一 種或幾種。
[0024] 本發(fā)明所述高效液相色譜反向鍵合相的超/亞臨界流體封端方法可廣泛應(yīng)用于 分析和/或制備反相HPLC、UHPLC或UPLC產(chǎn)品。產(chǎn)品品質(zhì)非常高。
[0025] 本發(fā)明還提供一種高效液相色譜柱，該色譜柱的鍵合相采用上述高效液相色譜反 相鍵合相的超/亞臨界流體封端方法進(jìn)行封端。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0027] (1)使用這種新的方法和工藝能徹底封閉殘留的活躍的硅烷醇基團(tuán)，生產(chǎn)完全電 荷中性的疏水反相鍵合相。
[0028] (2)使用這種新戰(zhàn)略（新的技術(shù)和工藝）生產(chǎn)的高效液相反相色譜柱或超高效液 相反相色譜柱，沒有殘留的活躍的硅烷醇基團(tuán)和堿性化合物陽(yáng)離子交換副作用，因此堿性 化合物（和酸性化合物，中性化合物，兩性化合物一樣）有非常對(duì)稱的峰形，保留時(shí)間和機(jī) 理完全遵循化合物疏水性從低到高的順序。
[0029] (3)堿性化合物柱效和峰形比現(xiàn)有技術(shù)制作的高效液相反相色譜柱或1. 7 ym UPLC超高效液相色譜柱，2. 6 y m核殼UHPLC高效液相反相色譜柱顯著提高。
[0030] (4)這種新的方法和工藝反應(yīng)條件溫和，反相鍵合相無(wú)損傷，色譜柱壽命長(zhǎng)。
[0031] (5)生產(chǎn)批次重復(fù)性很好。
[0032] (6)超臨界流體和亞臨界流體封閉方法生產(chǎn)堿性化合物柱效和峰形比現(xiàn)有技術(shù)制 作的高效液相反相色譜柱或1. 7 y m UPLC超高效液相色譜柱、2. 6 y m核殼UHPLC高效液相 反相色譜柱在LC-MS的TIC分析中鍵合相非常穩(wěn)定，無(wú)泄漏。
[0033] (7)本發(fā)明提供的方法確保綠色化學(xué)，最大限度地減少有毒的有機(jī)溶劑如甲苯的 使用，最大限度地減少對(duì)環(huán)境的污染，并可實(shí)現(xiàn)工藝連續(xù)化和半自動(dòng)化。
【附圖說明】
[0034]圖1是本發(fā)明超/亞臨界流體封端技術(shù)（左側(cè)）和固-液回流下的封端技術(shù)（右 偵D比較示意圖；
[0035] 圖2為代表性的反相鍵合相pH-表面電荷曲線比較結(jié)果；
[0036] 圖3為代表性的反相鍵合相Zeta電勢(shì)比較結(jié)果；
[0037] 圖4為用不同高效液相色譜柱檢測(cè)同一樣品阿米替林、丙咪嗪的結(jié)果比較，其中 A為常規(guī)液-固封端生產(chǎn)的l〇〇A C18 5 y m25cmX4. 6mm HPLC色譜柱，B為超臨界流體封 端生產(chǎn)的 10〇A C18 5ym25cmX4.6mm HPLC 色譜柱，C 為 Supelco 公司 Ascenti# C18 5ym25cmX4.6mm HPLC色譜柱，D為Supelco公司 Disc〇very?C18 5ym25cmX4.6mm HPLC 色譜柱，E 為 Waters 公司 Simfire? C18 5 ym25cmX4. 6mm HPLC 色譜柱。
[0038] 圖5:為超臨界流體封端生產(chǎn)的100A C18 5ym25cmX4. 6mm HPLC柱檢測(cè)氟西汀 的色譜圖。
[0039] 圖6為超臨界流體封端技術(shù)生產(chǎn)的5ym PFPP HPLC高效液相色譜柱做馬尿中阿 米雷司鑒定的結(jié)果，阿米雷司LC-MS/MS MRM峰（M+1 = 163) :18. 1分鐘，另一個(gè)活性代謝產(chǎn) 物（M+1 = 162)峰：28. 0 分鐘；
[0040] 圖7為亞臨界流體封端方法封端技術(shù)生產(chǎn)的300A C18色譜柱產(chǎn)生的肽圖譜；
[0041] 圖8為市場(chǎng)上知名品牌高效液相色譜柱1上面的肽圖譜；
[0042] 圖9為市場(chǎng)上知名品牌高效液相色譜柱2上面的肽圖譜；
[0043] 圖10為通過超臨界流體封端生產(chǎn)的1. 7 y m UPLC穩(wěn)定酰胺超高效液相色譜柱對(duì) 中草藥有效成分的分離結(jié)果；
[0044] 圖11為超臨界流體封端技術(shù)生產(chǎn)的2. 6 y m C18核殼UHPLC超高效液相色譜柱測(cè) 定大鼠腦微透析液中的精氨酸和組氨酸的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的 理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0046] 實(shí)施例1 :5 y m C18鍵合相超臨界流體封端
[0047] 傳統(tǒng)固_液回流封端方法：采用日本Daiso公司丨20A 5 y m B型球形硅膠和硅烷 試劑十八烷基二甲基氯硅烷作為原材料，使用甲苯為溶劑，咪唑和吡啶為催化劑，在甲苯回 流溫度用氮?dú)獗Ｗo(hù)回流24小時(shí)，洗滌后獲得C18鍵合相。技術(shù)參數(shù)：比表面積300m2/g，鍵 合密度 3. 2ymol/m2。
[0048] 100g C18鍵合相使用三甲基氯硅烷為封端試劑，和1，1，1，3, 3, 3-六甲基二硅亞 胺、N，N-二甲基三甲基硅胺等為催化劑，在甲苯回流溫度用氮?dú)獗Ｗo(hù)回流24小時(shí)。反應(yīng)后 使用甲苯，二氯甲烷，乙腈，甲醇和水（50:50)，丙酮依次洗，80°C氮?dú)獗Ｗo(hù)干燥，冷卻下來后 使用。
[0049] 本發(fā)明的超臨界流體封端方法：100g C18鍵合相放置到圖1左側(cè)SC-方法所示超 臨界流體設(shè)備中間位置S和I，過量（封端試劑與C18鍵合相硅醇基的摩爾濃度比為2:1)三 甲基氯硅烷和1，1，1，3, 3, 3-六甲基二硅亞胺，N，N-二甲基三甲基硅胺作為封端試劑和催 化劑放置到圖1超臨界流體設(shè)備中間位置2。反應(yīng)體系的溫度首先上升到31. 2°C，壓強(qiáng)上 升到73. 8bar，這個(gè)時(shí)候0)2變成超臨界流體。反應(yīng)體系的溫度10分鐘內(nèi)上升到100°C，壓 強(qiáng)上升到414bar，超臨界流體封端持續(xù)3~8小時(shí)。反應(yīng)后，使用新鮮的C0 2超臨界流體快 速清洗20~30分鐘，冷卻，減壓。進(jìn)一步使用乙腈，甲醇和水（體積比50:50)的混合液， 丙酮依次洗，80°C氮?dú)獗Ｗo(hù)干燥，冷卻下來后使用，標(biāo)記為Novel C18。
[0050] 實(shí)施例2:表面電荷滴定
[0051] 表面電荷滴定，Zeta電勢(shì)是膠體與界面科學(xué)領(lǐng)域兩個(gè)最重要的表面表征技術(shù)。滴 定方法：10克色譜鍵合相放置在電位滴定室內(nèi)，用10mM氯化鈉（80 % )和甲醇（20 % )作為 液相，用〇? 1M鹽酸調(diào)整pH值至3. 0,從pH值3. 0在氮?dú)獗Ｗo(hù)下用0? 1M NaOH滴定到pH8， 又用0. 1M鹽酸返滴定到pH3. 0,再一次用0. 1M