凝膠模式化的表面的制作方法
【專利說明】凝膠模式化的表面
[0001] 相關(guān)申請的奪叉引用
[0002] 本申請要求2013年2月26日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?1/769, 289和2013年3月 6日提交的美國申請?zhí)?3/787, 396的權(quán)益。以上申請的每一個(gè)在此通過引用以其整體被并 入。
[0003] 置量
[0004] 本公開內(nèi)容一般涉及固相分析化學(xué)并且對用于高通量基因組分析的核酸陣列具 有特定的適用性。
[0005] 將人類遺傳變異編目和將此變異與對疾病的敏感性相關(guān)聯(lián)的任務(wù)堅(jiān)持從基因組 廣泛測序方法學(xué)的發(fā)展中獲益。此編目嘗試為鑒定每一個(gè)人的基因組中的標(biāo)志物帶來希 望，其將有助于醫(yī)學(xué)專業(yè)人士確定該人對疾病的敏感性、對例如處方藥物的特定治療的響 應(yīng)性、對危險(xiǎn)藥物副作用的敏感性和其他醫(yī)學(xué)上可操作的特征。編目嘗試正在順利進(jìn)行中。 這很大程度上是由于商業(yè)上可得的基因組測序方法學(xué)，該方法學(xué)是足夠具有成本有效的以 允許在研宄環(huán)境中測試被評價(jià)的受試者。需要測序方法學(xué)的改進(jìn)以加速編目嘗試。此外， 測序的相對高成本阻止了技術(shù)超越研宄中心并進(jìn)入診所，其中醫(yī)生可以獲得一般人群中患 者的序列。
[0006] 測序方法學(xué)和用于實(shí)施其的系統(tǒng)利用復(fù)雜的技術(shù)集合。這些技術(shù)的一些中的改進(jìn) 已經(jīng)顯示提供大幅度成本降低。然而，難以預(yù)測哪些（如果有的話）對成本降低改進(jìn)負(fù)有 責(zé)任。考慮到測序系統(tǒng)中的技術(shù)之間的依賴性，甚至更加難以預(yù)測哪些可以被修改而對方 法學(xué)或系統(tǒng)的整體性能沒有不利影響。因此，對鑒定可以給診所帶來基因組研宄的希望的 改進(jìn)存在需要，在診所中生命可以被改善并且在許多情況下被拯救。本發(fā)明滿足這種需要 并且也提供相關(guān)優(yōu)勢。
[0007]
[0008] 本公開內(nèi)容提供了一種陣列，所述陣列包括具有表面的固體支撐體，所述表面具 有多個(gè)孔，所述孔含有凝膠材料，所述孔被所述表面上的空隙區(qū)彼此分開，所述空隙區(qū)將 所述孔的每一個(gè)中的凝膠材料與其他多個(gè)孔中的凝膠材料分離；和所述凝膠材料中的靶 標(biāo)核酸的文庫，其中所述孔的每一個(gè)中的凝膠材料包含所述文庫的靶標(biāo)核酸的單一物質(zhì) (species)〇
[0009] 在一些實(shí)施方案中，基底被配置為孔的陣列并且分析物是核酸。相應(yīng)地，本公開內(nèi) 容提供了一種陣列，所述陣列包括具有表面的固體支撐體，所述表面具有多個(gè)孔，所述孔含 有凝膠材料，所述孔被所述表面上的空隙區(qū)彼此分開，所述空隙區(qū)將所述孔的每一個(gè)中的 凝膠材料與其他多個(gè)孔中的凝膠材料分離；和所述凝膠材料中的靶標(biāo)核酸的文庫，其中所 述孔的每一個(gè)中的凝膠材料包含所述文庫的靶標(biāo)核酸的單一物質(zhì)。
[0010] 本公開內(nèi)容還提供了制備基底的方法。所述方法可包括以下步驟：(a)提供具有 平面表面的固體支撐體，其中所述平面表面被一個(gè)或更多個(gè)凹特征中斷并且其中所述平面 表面上的一個(gè)或更多個(gè)空隙區(qū)形成所述一個(gè)或更多個(gè)凹特征的邊界；(b)用凝膠材料包被 至少一部分固體支撐體，其中所述部分包括至少一個(gè)凹特征和至少一個(gè)空隙區(qū)；以及（C) 拋光所述平面表面以從所述至少一個(gè)空隙區(qū)移除所述凝膠材料并且維持所述凝膠材料在 至少一個(gè)凹特征中。
[0011] -種制備陣列的方法，所述方法可包括以下步驟：(a)提供具有表面的固體支撐 體，所述表面具有多個(gè)孔，所述孔含有凝膠材料，所述孔被所述表面上的空隙區(qū)彼此分開， 所述空隙區(qū)將所述孔的每一個(gè)中的凝膠材料與其他多個(gè)孔中的凝膠材料分離；(b)將靶標(biāo) 核酸的文庫遞送至所述固體支撐體的孔以產(chǎn)生具有附接至每一個(gè)孔中的凝膠材料的靶標(biāo) 核酸的單一物質(zhì)的孔的陣列，其中所述陣列中的不同的孔具有來自所述文庫的不同靶標(biāo)核 酸物質(zhì)；以及（c)擴(kuò)增附接至所述陣列的孔中的凝膠材料的所述靶標(biāo)核酸以在所述陣列的 孔的每一個(gè)處產(chǎn)生個(gè)體靶標(biāo)核酸的克隆群體。
[0012] 本公開內(nèi)容還提供了檢測分析物的方法。所述方法可包括以下步驟：(a)提供具 有平面表面的固體支撐體，其中所述平面表面被一個(gè)或更多個(gè)凹特征中斷，其中所述凹特 征包含凝膠材料，其中所述平面表面上的一個(gè)或更多個(gè)空隙區(qū)形成所述一個(gè)或更多個(gè)凹特 征的邊界，所述空隙區(qū)基本上沒有所述凝膠材料，并且其中所述凝膠材料被附接至或包含 靶標(biāo)分析物；(b)在其中所述靶標(biāo)分析物與探針特異性相互作用的條件下將所述固體支撐 體與所述探針接觸；以及（c)檢測所述固體支撐體以區(qū)分與一個(gè)或更多個(gè)探針相互作用的 所述靶標(biāo)分析物的至少一個(gè)子集。
[0013] 在特定的實(shí)施方案中，核酸是被檢測的分析物并且凹特征是孔。例如檢測核酸的 方法可包括以下步驟：(a)提供具有表面的固體支撐體和核酸的文庫，所述表面具有多個(gè) 孔，所述孔含有凝膠材料，所述孔被所述表面上的空隙區(qū)彼此分開，所述空隙區(qū)將所述孔的 每一個(gè)中的凝膠材料與其他多個(gè)孔中的凝膠材料分離，所述文庫的靶標(biāo)核酸的單一物質(zhì)被 附接至所述孔的每一個(gè)中的凝膠材料；(b)將所述固體支撐體與結(jié)合至所述靶標(biāo)核酸的至 少一種探針接觸；以及（c)檢測所述固體支撐體以區(qū)分具有結(jié)合至所述至少一種探針的靶 標(biāo)核酸物質(zhì)的孔。
[0014] 本公開內(nèi)容的組合物、設(shè)備和方法在本文就凝膠材料而言被示例。將被理解的是， 凝膠材料是示例性的并且可以用其他有機(jī)材料來替代，所述其他有機(jī)材料包括，例如可以 形成表面包被并且可以不必然被認(rèn)為是凝膠自身的聚合物。本文列出的用于向表面應(yīng)用凝 膠材料、從空隙區(qū)移除凝膠材料、將分析物附接至凝膠材料、在分析或制備方法中使用獲得 的陣列等的方法可以通過用非凝膠材料替代凝膠材料容易地修改。
[0015] 附圖簡沐
[0016] 圖1顯示了用于制備和使用DNA特征的模式化的陣列的方法的圖解表示，其中每 一個(gè)特征是具有被附接至DNA簇的凝膠材料的孔并且陣列在測序技術(shù)中被使用。
[0017] 圖2顯示了來自被修改為具有凝膠材料而不是珠在孔中的BeadChip基底的圖像。 圖A :拋光之前獲得的明視野圖像。圖B-C :拋光之后和雜交至熒光標(biāo)記的寡核苷酸之后獲 得的熒光圖像。
[0018] 圖3顯示圖A中：利用光刻術(shù)和Cr硬掩膜與反應(yīng)性離子蝕刻一起以制造基底中的 凹特征的圖解過程流；圖B中，玻璃基底中的孔和基準(zhǔn)（fiducial)部分的示例SEM圖像；以 及圖C中，薄片（wafer)的圖像、包括基準(zhǔn)和孔的陣列的薄片的部分的圖像、以及來自包括 孔的陣列的部分的圖像。
[0019] 圖4顯示了納米孔基底的高分辨率熒光顯微鏡圖像，顯示了基底用PAZAM包被并 且用硅珠漿料拋光之后納米孔基底上的模式化的凝膠特征。PAZAM用染料標(biāo)記用于可視化 目的。
[0020] 圖5顯示了從具有模式化的簇的1. 5 μπι孔距納米孔基底的HiSeq測序循環(huán)獲得 的多色圖像融合。圖A :顯示含有凝膠的孔中模式化的簇以及四個(gè)靶眼（bulls-eye)基準(zhǔn) 的視野的圖像。圖B :顯示單個(gè)靶眼基準(zhǔn)中顏色的混合（由于擴(kuò)增子的混合的群體）的更 高分辨率圖像。
[0021] 圖6顯示了圖A中：用750nm孔距納米孔基底運(yùn)行的Hiseq測序中模式化的簇的 多色融合；圖B :顯示陣列被排序并且簇正通過質(zhì)量濾器的最鄰近曲線（nearest neighbor curve);以及圖C :測序質(zhì)量度量，顯示以1，600, 000簇/mm2的密度，成功通過質(zhì)量濾器。
[0022] 圖7顯示了克隆分?jǐn)?shù)（Fraction clonal)對占據(jù)的分?jǐn)?shù)（Fraction occupied)的 圖，具有針對泊松分布預(yù)計(jì)的曲線、針對理想克隆性和占據(jù)預(yù)計(jì)的直線、以及X代表從用具 有含有凝膠的納米孔的模式的基底的測序運(yùn)行獲得的平均量度。
[0023] 詳沭
[0024] 本公開內(nèi)容提供了結(jié)構(gòu)化的基底（structured substrate)、用于制備結(jié)構(gòu)化的基 底的方法和用于使用結(jié)構(gòu)化的基底的方法。在特定的實(shí)施方案中，基底包括固體支撐體，所 述固體支撐體具有含有凝膠材料（例如被凝膠材料包被）的凹區(qū)例如孔。凝膠材料可以轉(zhuǎn) 而被附接至感興趣的分析物，例如核酸。在特定的實(shí)施方案中，含有凝膠的區(qū)是離散的，被 缺少附接感興趣的分析物的能力的空隙區(qū)分開。例如，空隙區(qū)可以缺少凝膠材料?？蛇x地， 空隙區(qū)中的凝膠材料可被滅活或以其他方式被修飾以缺少凹區(qū)中凝膠材料的活性或特征， 例如支持分析物附接的能力。當(dāng)在分析物上進(jìn)行反應(yīng)和/或檢測分析物時(shí)，所得凝膠區(qū)的 分離提供優(yōu)勢。示例性優(yōu)勢可以在分布在含有凝膠的孔中的靶標(biāo)核酸的陣列的實(shí)例中來展 示。這里，擴(kuò)增反應(yīng)可以使用核酸作為模板在結(jié)構(gòu)化的基底上來實(shí)施以形成在凝膠中或凝 膠上生長的核酸集群（colony)(例如陣列的核酸特征）?？障秴^(qū)功能為限制用于集群生長 的區(qū)域。由于由含有凝膠的孔創(chuàng)建的離散模式，所得陣列的個(gè)體特征可以相對容易地區(qū)分。 相比于核酸的隨機(jī)陣列，模式還可以提供提高特征的密度和降低用于圖像配準(zhǔn)的處理要求 的益處。
[0025] 用于制備模式化的核酸陣列的示例性過程顯示在圖1中?？啄Ｊ交幕椎膫?cè) 面圖被圖解顯示?？拙哂?.5 μπι的孔距（中心距）并且在該實(shí)例中每一個(gè)孔的直徑是 0.5 μπι?？啄Ｊ交幕卓梢杂媚z材料來包被使得材料進(jìn)入孔并且包被空隙區(qū)。所得凝 膠包被的基底可以被拋光以從空隙區(qū)移除凝膠材料，將凝膠材料留在孔中，從而形成凝膠 模式化的基底。凝膠可以具有支持捕獲DNA模板和擴(kuò)增模板的功能。例如，在表面包被之 前、表面包被之后和拋光之前或拋光之后，凝膠可以用寡核苷酸引物來接枝。引物可以具有 捕獲DNA模板和使用捕獲的模板引發(fā)擴(kuò)增的功能。所得DNA模式化的基底可以被例如在測 序技術(shù)中分析。
[0026] 模式化的含有凝膠的孔中的核酸陣列提供用于DNA測序的多種優(yōu)勢。相比隨機(jī)陣 列（即，具有隨機(jī)的特征模式的陣列）的優(yōu)勢的實(shí)例包括提高的特征堆積的密度、增強(qiáng)的使 用濃度不依賴的模板接種的特征密度的控制和調(diào)整、減少的用于圖像配準(zhǔn)的處理需求和提 高的信號提取的容易性。另外的優(yōu)勢可以源于由每一個(gè)特征提供的核酸群體的空間限定。 本公開內(nèi)容的模式化的陣列的特征可以具有限制其中核酸集群將會生長（例如，經(jīng)由簇?cái)U(kuò) 增）的面積或體積的功能。缺乏面積或體積限制時(shí)，由于影響相對擴(kuò)增速率的其序列中鳥 嘌呤和胞嘧啶的百分含量（即，GC含量）的差異，一些核酸集群可以擴(kuò)增至比其他的更大 尺寸。對于本文列出的方法和組合物，個(gè)體特征的體積或面積可以被選擇以阻止或最小化 核酸集群尺寸的差異，所述核酸集群尺寸的差異否則由于被擴(kuò)增的模板物質(zhì)之間的GC含 量不同，會從擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生。例如，特征的體積或面積可以是足夠小以完成最快生長集群的 生長同時(shí)允許較慢生長的集群在完成擴(kuò)增反應(yīng)后有效填充特征。
[0027] 在特定的實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了玻璃、硅、塑料或其他合適的固體支撐體 上的具有模式化的、共價(jià)連接的凝膠例如聚（N-(5-疊氮基乙酰胺基戊基）丙烯酰胺共丙烯 酰胺）（PAZAM，參見，例如美國臨時(shí)專利申請序列號61/753, 833,其通過引用并入本文）的 孔（例如微米孔和納米孔）的制備。該過程創(chuàng)建了用于測序的凝膠墊（gel pad)，其經(jīng)過運(yùn) 行大量循環(huán)的測序可以是穩(wěn)定的。將聚合物共價(jià)連接至孔對在多種使用過程中結(jié)構(gòu)化的基 底的整個(gè)壽命期間維持凝膠在結(jié)構(gòu)化的特征中是有益的。然而，在許多實(shí)施方案中，凝膠不 需要被共價(jià)連接至孔。例如，在一些條件下，無硅烷丙稀酰胺（silane free acrylamide) (SFA，參見，例如美國專利申請公布號2011/00598651 A1，其通過引用并入本文）可以被用 作凝膠材料，所述無硅烷丙烯酰胺未共價(jià)附接至結(jié)構(gòu)化的基底的任何部分。
[0028] 在特定的實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)化的基底可以通過以下來制備：用孔（例如微米孔或 納米孔）模式化固體支撐材料、用凝膠材料（例如，PAZAM、SFA或其化學(xué)改性的變體例如 SFA的疊氮化變體（疊氮SFA))包被模式化的支撐體以及拋光凝膠包被的支撐體，所述拋光 例如經(jīng)由化學(xué)或機(jī)械拋光，從而將凝膠保留在孔中但是從結(jié)構(gòu)化的基底的表面上、孔之間 的空隙區(qū)基本上移除或滅活所有凝膠。引物核酸可以被附接至凝膠材料。然后，靶標(biāo)核酸 (例如片段化的人類基因組）的溶液可以與拋光的基底接觸使得個(gè)體靶標(biāo)核酸將經(jīng)由與附 接至凝膠材料的引物的相互作用接種個(gè)體孔；然而，由于凝膠材料的缺乏或失活，靶標(biāo)核酸 將不會占據(jù)空隙區(qū)。靶標(biāo)核酸的擴(kuò)增將會被限制于孔，因?yàn)榭障秴^(qū)凝膠的缺乏或失活阻止 生長中的核酸集群向外迀移。該過程是方便可制造的，是可擴(kuò)展的（scalable)并且利用傳 統(tǒng)的微米或納米制備方法。
[0029] 在特定的實(shí)施方案中，基準(zhǔn)標(biāo)志物（fiducial marker)被包括在結(jié)構(gòu)化的基底上 以輔助識別和定位個(gè)體特征（例如，孔或其他含有凝膠的凹特征）?；鶞?zhǔn)標(biāo)志物對于具有 空間有序的特征模式的結(jié)構(gòu)化的基底是特別有用的，因?yàn)榛鶞?zhǔn)標(biāo)志物提供用于其他特征的 相對位置的參照點(diǎn)?；鶞?zhǔn)標(biāo)志物也可以被用于配準(zhǔn)隨機(jī)陣列的圖像，但是固有的無序的簇 可以被替代使用，例如如在商業(yè)測序平臺上產(chǎn)生的隨機(jī)陣列使用的，所述商業(yè)測序平臺例 如來自 Illuminate，Inc. (San Diego，CA)的 HiSeq、Genome Analyzer 或 MiSeq 平臺?；?準(zhǔn)標(biāo)志物對于其中結(jié)構(gòu)化的基底被重復(fù)檢測以追蹤隨時(shí)間推移在個(gè)體特征處發(fā)生的變化 的應(yīng)用是尤其有益的。基準(zhǔn)標(biāo)志物允許通過經(jīng)多重測序循環(huán)獲得的連續(xù)圖像追蹤個(gè)體核酸 簇，使得個(gè)體簇的序列可以被分開地確定。
[0030] 本公開內(nèi)容提供了具有凹區(qū)和空隙區(qū)的模式的基準(zhǔn)標(biāo)志物。用于基準(zhǔn)標(biāo)志物的示 例性設(shè)計(jì)是一組具有兩種或更多種以下的交替模式的同心圓：凹環(huán)、空隙環(huán)和孔的環(huán)或其 他凹特征（例如"靶眼"）。在一些實(shí)施方案中，基準(zhǔn)標(biāo)志物的凹區(qū)含有凝膠材料，而空隙區(qū) 則不含。凝膠在表面上的此不同定位可以使用本文列出的凝膠包被和拋光方法來實(shí)現(xiàn)。通 常使用可以區(qū)分含有凝膠的區(qū)和空隙區(qū)的檢測方法。在一些情況中，該區(qū)分可以基于凝膠 區(qū)中特定分析物的存在，所述特定分析物不存在于空隙區(qū)。例如，在核酸陣列的情況中，基 準(zhǔn)標(biāo)志物的含有凝膠的區(qū)可以含有經(jīng)由被用于標(biāo)記陣列上靶標(biāo)核酸的相同方法被標(biāo)記的 核酸。因此，基準(zhǔn)標(biāo)志物可以使用用于制造分析物特征的相同方法來方便地制造。相應(yīng)地， 如果需要，基準(zhǔn)標(biāo)志物和分析物特征可以通過一個(gè)或更多個(gè)步驟同時(shí)制造?？梢员挥糜诒?文中列出的結(jié)構(gòu)化的基底和方法中的另一種有用的基準(zhǔn)標(biāo)志物是具有亞區(qū)的基準(zhǔn)標(biāo)志物， 其中在一個(gè)亞區(qū)中孔（或其他凹特征）的模式相對于另一個(gè)亞區(qū)中的模式被旋轉(zhuǎn)。這樣的 基準(zhǔn)柵格可以被配置并用于圖像配準(zhǔn)，如美國序列號13/267,565中列出的，其通過引用并 入本文。
[0031] 作為另外的實(shí)例，珠可以被用作基準(zhǔn)。珠可包括標(biāo)記物例如，熒光團(tuán)。在這種情況 中，表面可以具有至少兩種類型的孔（或其他凹特征）。相對大的孔可以容納一個(gè)或更多個(gè) 基準(zhǔn)珠，而較小的孔，太小不含珠，僅具有凝膠材料。因此，較小的孔具有作為用于分析的分 析特征的功能并且較大的、填充珠的孔具有作為基準(zhǔn)的功能。作為孔的替代物，基準(zhǔn)特征可 以是通道，例如存在于以上示例的靶眼裝置中的那些，并且通道可以具有容納珠的尺寸。如 此，若干珠可以被置于通道中以創(chuàng)建基準(zhǔn)，例如以一串珠的外觀形狀。
[0032] 模式化的陣列，用于其制造的方法和用于其使用的方法在本文就被用于附接感興 趣的分析物的凝膠材料而言被示例。將要理解的是，凝膠材料是示例性的并且可以用其他 有機(jī)材料來替代，所述其他有機(jī)材料可以被用以介導(dǎo)分析物至表面上特征的定位。這樣的 有機(jī)材料包括例如，可以形成表面包被并且可以不必需被認(rèn)為是凝膠自身的聚合物。特定 的實(shí)例是由ATRP(原子轉(zhuǎn)移自由基聚合）或表面引發(fā)的聚合過程形成的聚合物。本文列出 的用于向表面應(yīng)用凝膠材料、從空隙區(qū)移除凝膠材料、在分析或制備方法中使用獲得的陣 列等方法可以容易地被調(diào)整用于使用非凝膠材料。
[0033] 除非另外指定，本文使用的術(shù)語將被理解為采用其在相關(guān)領(lǐng)域中的普通含