專利公布號2012/0055100、美國專利號7, 115, 400、美國專利公 布號2004/0096853、美國專利公布號2001/0002090、美國專利公布號2007/0128624和美國 專利公布號2008/0009420中，其中每一個通過引用被并入本文。PCR擴增也可以以擴增引 物之一附接至凝膠材料并且第二引物在溶液中來實施。使用一種固相附接的引物和溶液 相引物的組合的示例性格式是乳液PCR，例如，如Dressman等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822(2003)、WO 05/010145、或美國專利公布號 2005/0130173 或 2005/0064460 中描述的，其中每一個通過引用被并入本文。乳液PCR是該格式的示例并且將要理解的是， 為了本文列出的方法的目的，乳液的使用是任選的，并且事實上對于多種實施方案不使用 乳液。此外，引物不需要直接被附接至如ePCR參考文獻中列出的固體支撐體并且而是可被 附接至如本文中列出的凝膠材料。在一些固相PCR或橋式擴增格式中，靶標核酸可以被附 接至凝膠材料并且被用作用于擴增的模板。
[0079] RCA技術可以被修改用于本公開內容的方法中?？梢员挥糜赗CA反應 的示例性組分以及RCA藉以產生擴增子的原理被描述在例如Lizardi等人，Nat. Genet. 19:225-232(1998)和美國專利申請公布號2007/0099208 Al中，其中每一個通過引 用被并入本文。用于RCA的引物可以是在溶液中或被附接至凝膠材料。
[0080] MDA技術可以被修改用于本公開內容的方法。用于MDA的一些基本原理和有用 的條件被描述在例如 Dean 等人，Proc Natl. Acad. Sci. USA，99 :5262-66(2002) ;Lage 等 人，Genome Research 13:294-307(2003) ;Walker 等人，Molecular Methods for Virus Detection，Academic Press，Inc，1995 ;Walker 等人，Nucl. Acids. Res，20:1691-96 (1992); 美國專利號5,445, 166、5, 130, 238和6, 214, 587中，其中每一個通過引用被并入本文。用 于MDA的引物可以是在溶液中或被附接至凝膠材料。
[0081] 在特定的實施方案中，以上示例的擴增技術的組合可以被使用。例如RCA和MDA可 以被組合使用，其中RCA被用以在溶液中產生多聯體擴增子（例如，使用溶液相引物）。然 后，使用被附接至凝膠材料的引物，擴增子可以被用作用于MDA的模板。在該實例中，在組 合的RCA和MDA步驟之后產生的擴增子將被附接至凝膠材料。擴增子通常將含有靶標核苷 酸序列的多聯體重復段。
[0082] 擴增技術，例如以上示例的那些，可以被用以產生具有靶標核酸的多個拷貝的含 有凝膠的特征。個體特征，例如孔，可以具有以單一分子多聯體的形式的核苷酸序列的克隆 群體，例如由RCA產生的那些，或以具有相同序列的許多核酸分子的形式，例如由橋式PCR 產生的那些。通常具有擴增的靶標的若干拷貝的核酸將被附接至凝膠材料。
[0083] 對于一些應用，個體的含有凝膠的孔（或其他凹特征）可以主要用來自第一靶標 核酸的擴增子來填充并且也可以具有低水平的來自第二靶標核酸或來自擴增期間發(fā)生的 自發(fā)突變的污染性擴增子。陣列可以具有一個或更多個擴增位點，所述一個或更多個擴增 位點具有足夠低水平的污染性擴增子以便對陣列的隨后使用不會具有不可接受的影響。例 如，當陣列將在檢測應用中被使用時，可接受的污染水平將是不會以不可接受的方式影響 檢測技術的信噪比或分辨率的水平。相應地，表觀的克隆性通常與通過本文列出的方法制 備的陣列的特定使用或應用相關。對于特定應用的在個體孔或其他特征處可以是可接受的 污染的示例性水平包括，但不限于至多〇. 1 %、〇. 5%、1 %、5 %、10%或25%的污染性擴增 子。陣列可包括具有這些示例性水平的污染性擴增子的一個或更多個孔或其他特征。例如， 陣列中多至5%、10%、25%、50%、75%或甚至100%的特征可以具有一些污染性擴增子。
[0084] 已經被包被在固體支撐體的表面上的凝膠材料可以共價地被附接至支撐體。如以 上列出的，將分析物例如核酸附接至凝膠材料的步驟可以在結構化的基底的制造中的多種 不同階段被實施。因此，在將分析物附接至凝膠材料之前或之后，凝膠材料可以被附接至固 體支撐體。將凝膠材料附接至固體支撐體可以使用任何有用的化學反應來實施，所述化學 反應包括但不限于在美國臨時專利序列號61/753, 833 (其通過應用被并入本文）中列出或 展示在下面實施例1II中的那些。將要理解的是，將凝膠材料附接至固體支撐體不是在所 有實施方案中必需的。因此，拋光凝膠包被的支撐體或使用拋光的基底的隨后的步驟可以 對具有凝膠材料的基底實施，所述凝膠材料任選地，但不是必需地共價附接至凹特征，例如 孔。
[0085] 本文列出的方法可包括從固體支撐體的表面移除凝膠材料的步驟。被包被在固體 支撐體上的凝膠材料可以使用多種技術的任一種從空隙區(qū)選擇性地被移除。例如，凝膠材 料可以通過機械拋光技術從具有凹特征和空隙區(qū)的固體支撐體移除。機械拋光可以通過向 固體支撐體的表面應用研磨力來實施。示例性的方法包括用珠漿研磨、用紙張或衣物擦拭、 刮擦等等。拋光的一個實例包括使用用3 ym二氧化硅珠漿料（水中10% w/v)包被的不起 毛（Iintless)(潔凈室等級）擦拭物（wipe)以移除空隙凝膠。拋光輪/研磨機也可以以 這種漿料來使用。機械拋光也可以使用流體噴射或氣體噴射以從空隙區(qū)移除凝膠來實現。
[0086] 拋光可包括化學拋光，例如丙烯酰胺的水解或基于自由基的降解（例如，通過 暴露至過氧化苯甲?；蛳♂尩倪^氧化氫，如描述在Kurenkov等人，Russian Journal of Applied Chemistry，75:1039-1050(2002) ;Caulfied 等人，Polym. 44:1331-1337(2003); 和 Caulfied 等人，Chem. Rev. 102:3067-3083 (2002)中的）。
[0087] 拋光還可包括化學和機械拋光方法的組合，其中含有顆粒的膠態(tài)懸浮液的化學漿 料被用以機械剝離并且然后從空隙區(qū)化學溶解凝膠材料的已位移的部分。拋光或清除空隙 區(qū)的其他方法包括基于粘合劑的技術，例如，其中對凝膠材料具有親和力的剛性、平面粘合 膜被包被在表面上，從而使得在空隙區(qū)中與凝膠材料緊密接觸（例如，通過化學連接）的技 術。這種粘合劑膜的機械移除/剝離將導致從空隙區(qū)機械移除凝膠材料，同時將凝膠材料 留在凹特征中。
[0088] 在另一個實例中，硫代磷酸鹽接枝的SFA可以如以下地從表面上的空隙區(qū)被移 除。水沾濕的Whatman擦拭物可蘸取氧化錯（~100mg，0.3ym)或鋼珠。然后可以使用 均勻壓力、以小的同心圓將形成的漿料擦在固體支撐體的表面上。然后，清潔的水濕潤的 Whatman擦拭物可被用以移除表面上的漿料。本文用于從空隙區(qū)移除凝膠材料示例的機械 的和化學的拋光方法也可以被用以在空隙區(qū)滅活凝膠材料，無論凝膠材料是否被移除。例 如，凝膠材料可以關于附接至分析物例如核酸的能力或關于支持核酸擴增的能力被滅活。
[0089] 制備陣列的方法可包括以下步驟：(a)提供具有表面的固體支撐體，所述表面含 有多個孔，所述孔含有凝膠材料，所述孔被表面上的空隙區(qū)彼此分開，所述空隙區(qū)將孔的每 一個中的凝膠材料與其他多個孔中的凝膠材料分離；(b)將靶標核酸的文庫遞送至固體支 撐體的孔以產生具有附接至每一個孔中的凝膠材料的靶標核酸的單一物質的孔的陣列，其 中陣列中的不同的孔具有來自文庫的不同的靶標核酸物質；以及（c)擴增附接至陣列的孔 中的凝膠材料的靶標核酸以在陣列的孔的每一個處產生個體靶標核酸的克隆群體。
[0090] 在若干實施方案中，本文列出的結構化的基底提供了將來自混合物的多種不同分 析物方便地遞送至表面上的個體化的位置，從而形成陣列的優(yōu)勢。結構化的基底有助于 將單一分析物從與基底接觸的分析物的混合物選擇性捕獲在每一個單獨的含有凝膠的孔 (或其他凹特征）。結構化的基底上的含有凝膠的孔（或其他凹特征）的模式和裝載的效 率可以被調整至獲得具有期望的特征的陣列，所述期望的特征例如分析物密度和關于具有 單一分析物物質的每一個特征的純度。例如，較高密度的孔可以被用以獲得陣列上較高密 度的分析物并且相反地較低密度的孔可以被用以獲得陣列上較低密度的分析物?？蛇x地或 另外地，溶液中分析物的濃度或量可以被提高以獲得陣列上較高密度的分析物或降低以獲 得陣列上較低密度的分析物。在每一個含有凝膠的孔（或其他凹特征）處分析物的平均純 度可以通過改變基底的特性或用于遞送分析物的條件來調整，如下面進一步詳細描述并展 示在實施例部分中的。
[0091] 在特定的實施方案中，孔（或其他凹特征）的尺寸或體積可以被調整以影響捕 獲的分析物的純度。例如，孔可以具有僅容納特定類型的單一分析物的凝膠材料的面積 或體積，使得空間排阻阻止多于一種分析物分子被捕獲或接種孔?？臻g排阻對于大分析 物例如核酸可以是特別有用的。更具體地，孔（或其他凹特征）可以存在具有等于或小 于將被接種在基底上的靶標核酸的排除體積的直徑的面積的凝膠表面。靶標核酸的排除 體積和其直徑可以例如從靶標核酸的長度來確定。確定核酸的排除體積和排除體積的 直徑的方法被描述在例如美國專利號7, 785, 790 ;Rybenkov等人，Pro. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 90:5307-5311 (1993) ;Zimmerman 等人，J. Mol. Biol. 222:599-620(1991);或 Sobel 等人，Biopolymers 31:1559-1564 (1991)中，其中每一個通過引用被并入本文。用于空間 排阻的條件被列在美國序列號13/661，524和美國專利號7, 785, 790中，其中每一個通過引 用被并入本文，并且可以被容易地用于本公開內容的結構化的基底。
[0092] 將要理解的是，在一些實施方案中，孔（或其他凹特征）可以存在具有基本上大于 將被轉移至擴增位點的靶標核酸的排除體積的直徑的面積的凝膠表面。因此，特征的面積 可以是足夠大的使得空間排阻不發(fā)生。
[0093] 在一些實施方案中，例如以上列出的空間排阻實施方案，靶標核酸的文庫在擴增 過程開始之前可以被遞送至固體支撐體的含有凝膠的孔（或其他凹特征）。例如，靶標核酸 可以在以靶標核酸接種基底中的凝膠材料的條件下被遞送至結構化的基底?；卓梢匀芜x 地被洗滌以移除未接種凝膠的靶標核酸以及對于基底的隨后處理或使用不期望的任何其 他材料。擴增可包括本文之前列出的一種或更多種技術。
[0094] 在可選的實施方案中，靶標核酸的文庫可以被遞送至固體支撐體的含有凝膠的孔 (或其他凹特征）并且擴增過程可以與接種事件同時發(fā)生。例如，接種可以在利用動力學 排阻的機制下發(fā)生，如在例如美國序列號61/715, 478 (其通過引用被并入本文）中描述的。 當過程以足夠快的速率發(fā)生時，動力學排阻可以發(fā)生以有效排除另一事件或過程發(fā)生。在 含有凝膠的孔的陣列的情形中，孔可以用來自溶液的靶標核酸隨機接種并且靶標核酸的拷 貝可以在擴增過程中產生以填充接種的位點的每一個達最大限度。接種和擴增過程可以在 其中擴增速率超過接種速率的條件下同時進行。如此，其中在已經被第一靶標核酸接種的 位點制備拷貝的相對快速的速率將有效地排除第二核酸接種用于擴增的位點。類似地，動 力學排阻可以利用用于制備靶標核酸的第一拷貝的相對慢的速率對用于制備靶標核酸或 第一拷貝的隨后拷貝的相對快速率。例如，由于在已經接種含有凝膠的孔的靶標核酸的第 一拷貝的形成中的延遲（例如延遲的或慢激活）對隨后的拷貝被制備以填充位點的相對快 的速率，動力學排阻可發(fā)生。在該實例中，個體的含有凝膠的孔可以已經用若干不同靶標核 酸（例如，若干靶標核酸可以在擴增之前存在于每一個位點）來接種。然而，針對任何給定 靶標核酸的第一拷貝的形成可以被隨機激活，使得第一拷貝的形成的平均速率相比于產生 隨后的拷貝的速率是相對慢的。在該情形中，盡管個體的含有凝膠的孔可以已經用若干不 同靶標核酸來接種，但是動力學排阻將允許只有那些靶標核酸的一種被擴增。通常，含有凝 膠的孔（或其他凹特征）可以用作美國序列號61/715, 478(其通過引用被并入本文）中列 出的方法中用于擴增的位點和陣列形成的位點。
[0095] 作為對從混合物中將多種不同分析物遞送至個體的含有凝膠的凹特征的替代選 擇，分析物可以從純原液被離散地遞送至個體特征。類似地，分析物可以通過離散遞送合 成構建模塊在個體特征合成（例如，核苷酸前體可以按順序地被遞送以合成核酸）。用于 遞送純分析物或用于在原位合成分析物的構建模塊的示例性的方法包括，但不限于噴墨陣 列布點和光刻陣列合成。有用的光刻術包括由Affymetrix(Santa Clara，CA)商業(yè)上使用 以制造 GeneChip? 微陣列或美國專利號 5, 324, 633、5, 744, 305、5, 624, 711、6, 022, 963、 6,291，183和6, 416, 949中描述的那些，其中每一個通過引用被并入本文。噴墨布點技術 (inkjet spotting technique)也是有用的，例如由 Agilent (Santa Clara, CA)商業(yè)化的用 于印刷 SurePrint?陣列或在美國專利號 6, 337, 393、6, 419, 833、6, 420, 180 或 6, 689, 319 中描述的那些。這樣的方法可以被容易地修改以指導遞送至本公開內容的含有凝膠的特 征。
[0096] 特定的凹特征中的凝膠材料不需要僅含有單一物質的分析物。相反，在一些實施 方案中，凹特征可以在其中的凝膠中含有若干不同物質的分析物。實例通過圖5中靶眼基 準標志物來展示。基準標志物包括兩個'亮'環(huán)形通道，兩個通道的每一個含有凝膠材料， 并且每一個亮通道中的凝膠材料被附接至多個不同核酸集群。亮通道中的核酸集群通過用 若干不同物質的靶標核酸接種每一個環(huán)來形成，所述若干不同物質的靶標核酸行使擴增程 序中的模板的功能?；鶞蕵酥疚镞€包括兩個'暗'環(huán)形區(qū)。暗環(huán)通過空隙表面模式來形成。 示例性靶眼通過以同心模式交替暗和亮環(huán)來形成。在圖5的實例中，結構化的基底還包括 含有凝膠的孔，所述含有凝膠的孔的每一個通常含有源自單一核酸靶標的克隆群體。孔存 在于亮和暗環(huán)之間的環(huán)形帶中。因此，基準具有空隙環(huán)、含有孔的帶和通道環(huán)的交替的模 式。相同擴增程序被用以同時生長孔中的克隆核酸集群和基準標志物中的混合的群體（參 見下面實施例1II)。具有環(huán)的交替的模式的基準的其他實例顯示在圖3B和圖3C中。
[0097] 本公開內容還提供了檢測分析物的方法。所述方法可包括以下步驟：(a)提供具 有平面表面的固體支撐體，其中平面表面被一個或更多個凹特征中斷，其中凹特征包含凝 膠材料，其中平面表面上的一個或更多個空隙區(qū)形成一個或更多個凹特征的邊界，空隙區(qū) 基本上沒有凝膠材料，并且其中凝膠材料被附接至靶標分析物或包含靶標分析物；(b)在 其中靶標分析物與探針特異性相互作用的情況下將固體支撐體與探針接觸；以及（C)檢測 固體支撐體以區(qū)分與一種或更多種探針相互作用的靶標分析物的至少一個子集。
[0098] 在特定的實施方案中，核酸是被檢測的分析物并且凹特征是孔。例如，檢測核酸的 方法可包括以下步驟：(a)提供具有表面和核酸文庫的固體支撐體，表面具有多個孔，孔含 有凝膠材料，孔被表面上的空隙區(qū)彼此分開，空隙區(qū)將孔的每一個中的凝膠材料與其他多 個孔中的凝膠材料分離，文庫的靶標核酸的單一物質被附接至孔的每一個中的凝膠