材料； (b)將固體支撐體與結合靶標核酸的至少一種探針接觸；以及（C)檢測固體支撐體以區(qū)分 具有結合至至少一種探針的靶標核酸物質的孔。
[0099] 本公開內容的含有核酸陣列的結構化的基底可以被用于多種目的的任一種。對 于核酸的特別期望的用途是用作與具有互補序列的靶標核酸雜交的捕獲探針。與捕獲 探針雜交的靶標核酸可例如經(jīng)由被募集至捕獲探針的標記物來檢測。用于通過與捕獲 探針的雜交檢測靶標核酸的方法是本領域中已知的并且包括例如，描述在美國專利號 7, 582, 420、6, 890, 741、6, 913, 884 或 6, 355, 431 或美國專利申請公布號 2005/0053980 A1、 2009/0186349 Al或2005/0181440 Al中的那些，其中每一個通過引用被并入本文。例如， 標記物可以借助于捕獲探針與具有標記物的靶標探針的雜交被募集至捕獲探針。在另一個 實例中，標記物可以通過將靶標探針與捕獲探針雜交被募集至捕獲探針，使得捕獲探針可 以通過對標記的寡核苷酸的連接作用（例如通過連接酶活性）或通過加入標記的核苷酸 (例如通過聚合酶活性）來延伸。
[0100] 核酸陣列還可以被用于測序程序，例如合成測序（SBS)技術。簡要地，SBS可以通 過將靶標核酸與一種或更多種標記的核苷酸、DNA聚合酶等接觸來開始。其中引物使用靶標 核酸作為模板來延伸的那些特征將摻入可以被檢測的標記的核苷酸。任選地，標記的核苷 酸可以另外包括可逆終止特性，所述可逆終止特性在核苷酸已經(jīng)被添加至引物之后，終止 另外的引物延伸。例如具有可逆終止子部分的核苷酸類似物可以被添加至引物，使得隨后 的延伸不發(fā)生，直到去封閉劑（deblocking agent)被遞送以移除該部分。因此，對于使用可 逆終止的實施方案，去封閉劑可以被遞送至流通池（在檢測發(fā)生之前或之后）。洗滌可以在 多個遞送步驟之間來實施。然后循環(huán)可以被重復η次以將引物延伸η個核苷酸，從而檢測 長度η的序列?？梢匀菀椎乇徽{整以與由本公開內容的方法產(chǎn)生的陣列一起使用的示例性 SBS程序、流體系統(tǒng)和檢測平臺被描述在例如Bentley等人，Nature，456:53-59 (2008) ;W0 04/018497 ;W0 91/06678 ;W0 07/123744 ;美國專利號 7, 057, 026 ;7, 329, 492 ;7, 211，414 ; 7, 315, 019或7, 405, 281和美國專利申請公布號2008/0108082 A1，其中每一個通過引用被 并入本文。
[0101] 使用循環(huán)反應的其他測序程序可以被使用，例如焦磷酸測序。焦磷酸測序檢測 無機焦磷酸（PPi)隨著特定核苷酸被摻入新生核酸鏈的釋放（Ronaghi等人，Analytical Biochemistry 242(1)，84_9(1996) ;Ronaghi， Gemome Res，ll(l)，3_ll(2001) ;Ronaghi 等 人，Science，281 (5375)，363 (1998);美國專利號 6, 210, 891 ;6, 258, 568 和 6, 274, 320,其中 每一個通過引用被并入本文）。在焦磷酸測序中，釋放的PPi可以通過被ATP硫酸化酶轉 化為三磷酸腺苷（ATP)來檢測，并且產(chǎn)生的ATP可以通過熒光素酶產(chǎn)生的光子來檢測。因 此，測序反應可以通過發(fā)光檢測系統(tǒng)來監(jiān)測。用于基于熒光的檢測系統(tǒng)的激發(fā)放射源不是 焦磷酸測序程序必需的?？梢员挥糜趯⒔沽姿釡y序應用于本公開內容的陣列的有用的流體 系統(tǒng)、檢測器和程序被描述在例如WIPO專利申請序列號PCT/US11/57111、美國專利申請公 布號2005/0191698 A1、美國專利號7, 595, 883和美國專利號7, 244, 559,其中每一個通過 引用被并入本文。
[0102] 連接測序（sequencing-by-ligation)也可以是有用的，包括例如描述在 Shendure 等人，Science，309:1728-1732(2005);美國專利號 5,599,675 ;和美國專利號 5,750,341中的那些，其中每一個通過引用被并入本文。一些實施方案可包括雜交測序 (sequencing-by-hybridization)程序，如在例如 Bains 等人，Journal of Theoretical Biology，135(3)，303-7(1988) ;Drmanac 等人，Nature Biotechnology，16,54-58 (1998); Fodor 等人，Science，251 (4995)，767-773 (1995);和 TO 1989/10977 中描述的，其中每一個 通過引用被并入本文。在連接測序和雜交測序程序二者中，存在于含有凝膠的孔（或其他 凹特征）的核酸經(jīng)受寡核苷酸遞送和檢測的重復循環(huán)。如本文或本文引用的參考文獻中列 出的用于SBS方法的流體系統(tǒng)，可以容易地被調整用于遞送用于連接測序或雜交測序程序 的試劑。通常，寡核苷酸被熒光標記并且可以使用熒光檢測器來檢測，所述熒光檢測器與本 文或本文引用的參考文獻中關于SBS程序描述的那些類似。
[0103] 一些實施方案可以利用包括實時監(jiān)測DNA聚合酶活性的方法。例如，核苷酸摻入 可以通過含有熒光團的聚合酶和γ磷酸鹽標記的核苷酸之間的熒光共振能量轉移（FRET) 反應或以零模式波導來檢測。用于基于FRET的測序的技術和試劑被描述在例如Levene 等人，Science，299,682-686 (2003) ;Lundquist 等人，Opt. Lett，33,1026-1028 (2008); Korlach 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，105,1176-1181 (2008)，其公開內容通過引用被并 入本文。
[0104] 一些SBS實施方案包括檢測將核苷酸摻入延伸產(chǎn)物后釋放的質子。例如，基 于檢測釋放的質子的測序可以使用電子檢測器和來自I on Torr ent (Gu i I for d，CT，Li fe Technologies子公司）商業(yè)上可得的相關技術或描述在美國專利申請公布號2009/002608 Al、2009/0127589 Al、2010/0137143 A1、或2010/0282617 Al 中的測序方法和系統(tǒng)，其中每 一個通過引用被并入本文。在特定的實施方案中，被用以檢測釋放的質子的電子檢測器可 以被改良以包括孔并且孔可以含有如本文列出的凝膠材料。
[0105] 對于本公開內容的陣列的另一個有用的應用是基因表達分析?；虮磉_可以使用 RNA測序技術，例如稱為數(shù)字RNA測序的那些來檢測或定量。RNA測序技術可以使用本領域 中已知的例如以上列出的那些測序方法學來實施?；虮磉_也可以使用雜交技術或使用多 重測定來檢測或定量，所述雜交技術通過與陣列的直接雜交來實施，所述多重測定的產(chǎn)物 在陣列上被檢測。本公開內容的陣列還可以被用以確定來自一個或更多個個體的基因組 DNA樣品的基因型。可以在本公開內容的陣列上實施的用于基于陣列的表達和基因分型分 析的示例性方法被描述在美國專利號7, 582, 420、6, 890, 741、6, 913, 884或6, 355, 431或美 國專利申請公布號 2005/0053980 Al、2009/0186349 A1、或 2005/0181440 A1，其中每一個 通過引用被并入本文。
[0106] 本公開內容的陣列的若干應用已經(jīng)在以上總體檢測的上下文中被示例，其中靶標 核酸的多個拷貝存在于每一個特征并且被一起檢測。在可選的實施方案中，單一核酸，無論 靶標核酸或其擴增子，可以在每一個特征處被檢測。例如，含有凝膠的孔（或其他凹特征） 可以被配置以包含單一核酸分子，所述單一核酸分子具有將被檢測的靶標核苷酸序列。多 種單一分子檢測技術的任一種可以被使用，包括例如對以上列出的總體檢測技術的改良， 以在提高的分辨率下或使用更靈敏的標記物檢測位點?？梢员皇褂玫膯我环肿訖z測方法的 其他實例被列在美國專利申請公布號2011/0312529 A1、美國序列號61/578, 684和美國序 列號61/540, 714,其中每一個通過引用被并入本文。
[0107] 將要理解的是，本公開內容的含有凝膠的基底（例如已經(jīng)由本文列出的方法產(chǎn)生 的）不需要被用于檢測方法。相反，結構化的基底可以被用以儲存核酸文庫。相應地，結構 化的基底可以以將核酸保存在其中的狀態(tài)被儲存。例如，具有被附接至核酸的含有凝膠的 孔的基底可以以干燥的狀態(tài)、冷凍的狀態(tài)（例如在液氮中）或在保護核酸的溶液中被儲存。 可選地或另外地，結構化的基底可以被用以復制核酸文庫。例如，具有被附接至核酸的含有 凝膠的孔的基底可以被用以創(chuàng)建來自陣列上一個或更多個孔的復制擴增子。
[0108] 下面的實施例預期闡明但不限制本發(fā)明。
[0109] 實施例1
[0110] 用無硅烷丙烯酰胺包被的多孔基底
[0111] 本實施例展示了用無硅烷丙烯酰胺（SFA)包被納米孔基底，隨后用硫代磷酸接枝 引物并且執(zhí)行將凝膠接枝的引物與互補的熒光寡核苷酸的雜交以證實功能化方法的成功。
[0112] 通常用于制造 BeadChip的芯片基底從Illumina (San Diego, CA)獲得。芯片由娃 或Zeonor (Zeon Corp.，Tokyo, Japan)制成，具有以具有L 5 μπι的孔距的六邊形模式排列 的0. 5 μπι的孔，但孔不含有珠。芯片用如下面列出的和圖1中圖解的凝膠墊來模式化。
[0113] 芯片被封裝在墊圈密封的室中并且氧氣通過以用于形成SFA的流體試劑置換來 移除。SFA在室中的芯片上聚合。用于形成SFA的試劑和用于聚合的條件另外如在美國專 利申請公布號2011/0059865 Al中描述的，其通過引用被并入本文。密封的室被用以將聚 合的混合物放置與芯片直接接觸并以確保完全消除空氣，因為SFA的自由基聚合是空氣敏 感過程。在聚合之后，引物如美國專利申請公布號2011/0059865 Al中列出的以及如以下 的被接枝至密封室中的SFA聚合物。將含有引物的溶液牽引穿過BeadChip的聚合物包被 的表面并且然后將混合物在65°C孵育I. 25h(將完全密封的組件置于大烘箱中）。
[0114] 該方法給出均一包被的基底。樣品圖像顯示在圖2的圖A中。為了創(chuàng)建離散聚 合物區(qū)，將位于基底上的孔之間的'過量'的聚合物使用機械拋光技術移除，所述機械拋光 技術利用DI水中氧化錯納米顆粒（300nm直徑）的衆(zhòng)料。IOwt. %的3微米二氧化娃顆粒 (Kisker Biotech GmbH, Steinfurt, Germany)的衆(zhòng)料也可以被使用。將表面使用不起毛的 光學薄紙用納米顆粒漿料手動擦洗。洗滌以移除漿料和聚合物殘渣之后，將熒光標記的探 針的溶液與芯片雜交。使用熒光顯微鏡捕獲的圖像顯示，該方法能夠產(chǎn)生具有清潔空隙區(qū) 的聚合物特征（圖2,圖B至C)。
[0115] 這些結果表明，與缺少來自空隙區(qū)的信號形成對比，在凝膠填充的孔處的熒光強 度是空間離散的。這些結果也展示了，凝膠模式化可以使用具有納米制備的孔的基底上非 共價地附接的凝膠材料來實現(xiàn)。
[0116] 實施例1I
[0117] 制造具有含有凝膠的納米孔的基底
[0118] 多種技術可以被用以制造結構化的陣列，所述陣列隨后可用凝膠材料裝載。
[0119] 該過程可以以空白基底/薄片開始并且將模式通過微米或納米制造技術引入基 底?；?薄片的材料可以是傳統(tǒng)的娃、玻璃、塑料、COC或多種可以被結構化的材料的任 一種。用于將模式化引入基底的示例性技術包括光刻技術、納米壓印技術、將結構壓制進入 基于塑料/COC的材料和塑料或COC在具有模式化于其中的結構的母模（master mold)中 的注塑成型?；诠饪绦g的方法通常將包括使用以分檔器或光刻機模式化的光刻膠，用將 存在于標線/光罩上的模式轉移進入光刻膠的放射物暴露，并且然后將抗蝕劑顯影以在基 底的頂部產(chǎn)生結構化的膜（光刻膠）。結構化的抗蝕劑潛在地是可以被用于隨后凝膠包被 的最終基底或抗蝕劑中的模式可以通過接下來的處理被轉移進入基底。接下來的過程步驟 將通常包括反應性離子蝕刻（基于等離子體的蝕刻）或濕蝕刻（基于化學的）過程。如果 模式被轉移進入基底，模式化的光刻膠隨后被移除以產(chǎn)生用于隨后凝膠包被的模式化的基 底?？梢云谕氖窃诠饪棠z下使用材料例如鉻或鈦（一種金屬）的犧牲膜（sacrificial film)，并且首先將光刻膠中的模式轉移至金屬膜并且然后使用該膜作為模式藉以被轉移 進入基底的硬罩。模式轉移進入基底后，膜被移除并且因此被認為是對制備過程犧牲的。如 果納米壓印被使用，壓印的光刻膠可以是犧牲材料并且類似地被用作中間工具以將模式化 的抗蝕劑轉移進入基底或抗蝕劑的變化形式可以被使用，使得壓印的抗蝕劑用作隨后包被 步驟的輸入。模式化之后會保持的抗蝕劑的實例將是基于溶膠凝膠的材料。
[0120] 表示結構化的基底如何可以被制備的圖示法顯示在圖3中并且描述在下面。模式 化的基底的圖像以多種放大水平顯示在圖3B和圖3C中。
[0121] 測序基底/流通池上化學特異性凝膠墊的創(chuàng)建可包括本實施例中之前列出的一 種或更多種納米制造技術。然后，該過程可任選地包括一個或更多個化學處理步驟，例如硅 烷化以允許隨后通過硅烷將凝膠聚合物與基底連接。然后使用化學/機械拋光（CMP)以移 除基底表面上的所有空隙聚合物。拋光過程將以自上而下的方式移除材料并且因為基底中 的結構化的特征有效偏離來自陣列的空隙區(qū)的平面，所以拋光將在移除結構化的特征之前 從空隙區(qū)移除聚合物。如果拋光過程在最優(yōu)時間之后被停止，結構將保持聚合物包被并且 空隙區(qū)將缺少聚合物。然后用引物接枝模式化的凝膠墊基底，在凝膠墊處接種靶標核酸并 且將靶標核酸用作用于在凝膠墊處創(chuàng)建核酸簇的模板。
[0122] 實施例1II
[0123] 用PAZAM包被的多孔基底
[0124] 本實施例顯示了含有凝膠的孔的陣列的制造、孔中核酸簇的擴增和簇中核酸的測 序。
[0125] 基底按照以下制造。使用納米壓印制造納米孔基底（400nm直徑、1.5μπι孔距、 300nm深的孔）。使用化學氣相沉積，將氨基硅烷（APTES或APTMS)單層/多層沉積在基底 的整個表面上。接下來，通過加入1ml的NHS丙烯酸酯溶液至表面，將以IOOmM濃度的丙烯 酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（Aldrich PN 8060)的IX磷酸鹽緩沖的鹽水（pH 7.4)溶液與氨 基硅烷表面反應，將其用薄的玻璃蓋玻片覆蓋并且允許反應在室溫進行1小時。然后通過 旋轉包被500 μ 1的水中2wt. % PAZAM溶液至新形成的丙烯酰胺功能化表面上，將聚合物 (PAZAM)應用至表面。PAZAM如在美國臨時專利申請序列號61/753, 833中描述的合成，其 通過引用被并入本文。在60°C隨后加熱PAZAM包被的基底1小時導致聚合物和表面之間的 共價連接。通過用水中l(wèi)〇wt%的3 μπι SiO2微顆粒漿料拋光表面，將空隙共價連接的聚合 物移除。在以上程序中，Janeway表面（MeCN中具有DIPEA的丙烯酰氯）可代替氨基硅烷 包被的表面使用。
[0126] 然后用引物接枝模式化的聚合物基底，如美國臨時專利申請序列號 61/753, 833(其通過引用被并入本文）中描述的。接來下，將接枝的引物的染料標記的 (Cy5)反向互補物以IXPBS緩沖溶液中20 μM的互補物濃度暴露至表面，并且然后用以噴 瓶應用的50ml IPBS緩沖液洗滌表面。用設置在Cy5掃描通道并使用450的PMT設置的 FLA 9500Typh〇〇n成像儀將基底上標記的互補物成像。還用高分辨率顯微鏡將基底上標記 的互補物成像，顯示聚合物/引物的模式化，沒有空隙聚合物/引物的剩余