本發(fā)明涉及一種數(shù)字化單分子電化學(xué)檢測(cè)堿性磷酸酶的方法，屬于分析檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)生命和自然的探索已經(jīng)深入到單細(xì)胞、單分子水平，給常規(guī)的分析方法帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)都是以分子聚集體為目標(biāo)，得到的是物質(zhì)的平均行為，往往掩蓋了許多重要信息。準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)單個(gè)分子，特別是DNA和蛋白質(zhì)等生物分子，在生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)中可以帶來(lái)新的突破。此外，單分子檢測(cè)可揭示分子的異質(zhì)性、分子間相互作用及單個(gè)分子的物理化學(xué)特性。顯微術(shù)、光學(xué)和電學(xué)是單分子檢測(cè)中三種主要的方法。

目前，單分子電化學(xué)(SEM)已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，主要分為兩類：(1)檢測(cè)單個(gè)電活性分子連續(xù)氧化還原循環(huán)后產(chǎn)生的電流。例如，利用單個(gè)二茂鐵分子在超微尖端電極和基底電極間的氧化還原循環(huán)實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)。雖然該方法可直接檢測(cè)電信號(hào)，無(wú)需信號(hào)轉(zhuǎn)換，但是布朗運(yùn)動(dòng)的不確定性、兩個(gè)納米間隙工作電極制備的困難及多個(gè)氧化還原循環(huán)的要求限制了其在生化中的應(yīng)用。(2)調(diào)控單個(gè)分子的氧化還原狀態(tài)，結(jié)合熒光技術(shù)。例如，利用分子在氧化態(tài)具有強(qiáng)熒光信號(hào)，而在還原態(tài)幾乎無(wú)熒光實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)。通過(guò)光譜電化學(xué)，單個(gè)氧化還原事件就可以實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè)，但是只有部分氧化還原分子具有可變的熒光強(qiáng)度。總的來(lái)說(shuō)，這些方法主要是從概念、方法學(xué)上探究SME，SME的可靠性問(wèn)題是其實(shí)際應(yīng)用中一個(gè)挑戰(zhàn)。目前，許多利用納米顆粒和酶的放大來(lái)提高方法的靈敏度，可達(dá)aM水平，為單分子檢測(cè)提供了可能。但是，可靠、準(zhǔn)確的定量方法的缺乏阻礙了SEM在復(fù)雜體系中的應(yīng)用。

在這里，我們提出了一種數(shù)字化單分子電化學(xué)檢測(cè)(dSMED)堿性磷酸酶的方法。與酶產(chǎn)物直接氧化信號(hào)相比，酶促金屬化可將信號(hào)提升約100倍，提供了一種高效信號(hào)放大策略，為單分子電化學(xué)檢測(cè)提供了可能。在數(shù)字化分析中，輸出信號(hào)讀出為“0”或“1”，不再考慮具體信號(hào)強(qiáng)度，其中“0”代表無(wú)目標(biāo)物分子，而“1”代表有目標(biāo)物分子?；诓此煞植脊?，目標(biāo)物濃度可簡(jiǎn)單地通過(guò)“0”的概率計(jì)算得到?？捎行У乇苊鈫蝹€(gè)分子的信號(hào)波動(dòng)帶來(lái)的影響，適合于生物體系中小概率事件的檢測(cè)，提高了SME在實(shí)際應(yīng)用中的可靠性和準(zhǔn)確性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種可靠、靈敏、準(zhǔn)確的數(shù)字化單分子電化學(xué)檢測(cè)堿性磷酸酶的方法。

本發(fā)明所提供的技術(shù)方案具體如下：

一種數(shù)字化單分子電化學(xué)檢測(cè)堿性磷酸酶的方法，包括以下步驟：

(1)以ITO玻片作為基底，以設(shè)計(jì)有n個(gè)微電極條帶的菲林膠片作為掩膜，進(jìn)行軟光刻，洗去曝光區(qū)的光刻膠后，用濃鹽酸浸泡后洗去光刻膠以外的ITO膜；然后洗去光刻膠，再用piranha溶液浸泡，最后將ITO玻片置于氯金酸溶液中，利用電沉積法在ITO玻片上修飾納米金顆粒，得到含n個(gè)納米金條帶的ITO玻片；其中，n≥10；

(2)在PDMS上打n×m個(gè)通孔，將通孔行列與納米金條帶對(duì)齊，利用等離子體鍵合法將PDMS鍵合到含n個(gè)納米金條帶的ITO玻片表面，得到納米金微電極陣列；其中，m≥10；

(3)用pH＝9.8的二乙醇胺溶液將堿性磷酸酶溶液稀釋，然后加入含對(duì)氨基磷酸酚和AgNO₃的溶液，混合均勻，得到預(yù)混反應(yīng)液；

(4)向納米金微電極陣列的每個(gè)小孔中滴加等體積的預(yù)混反應(yīng)液，37℃下反應(yīng)30min后，用超純水洗去小孔中多余的銀離子及對(duì)氨基磷酸酚，然后向每個(gè)小孔中加入KCl溶液，以Ag/AgCl絲作為對(duì)電極和參比電極，進(jìn)行線性伏安掃描，記錄銀的溶出伏安信號(hào)；當(dāng)小孔中不含堿性磷酸酶時(shí)，電信號(hào)讀出為0；當(dāng)小孔中至少含一個(gè)堿性磷酸酶分子時(shí)，電信號(hào)讀出為1；

(5)將電信號(hào)通過(guò)MATLAB程序轉(zhuǎn)換成多色球，通過(guò)統(tǒng)計(jì)暗球和亮球的個(gè)數(shù)計(jì)算0或1的概率，然后通過(guò)泊松分布公式計(jì)算預(yù)混反應(yīng)液中堿性磷酸酶的濃度。

優(yōu)選地：

軟光刻所使用的光刻膠為AZ4620光刻膠。

所述的piranha溶液為體積比7:3的濃硫酸/雙氧水混合液。

步驟(1)利用電沉積法在ITO玻片上修飾納米金顆粒的方式為：將ITO玻片置于氯金酸溶液中，以Ag/AgCl為電極，在恒電位-0.1V下靜置20秒。

n＝10,m＝50。

二乙醇胺溶液的濃度為0.5M；預(yù)混反應(yīng)液中堿性磷酸酶的濃度為1-50aM。

步驟(5)線性伏安掃描的條件為：電勢(shì)掃描范圍為-0.1V～0.2V，掃描速率為100mV/s。

納米金微電極陣列中每個(gè)納米金條帶的寬度為100μm，相鄰兩個(gè)納米金條帶間距為3mm。

PDMS上通孔的直徑為1mm。

本發(fā)明的原理具體為：?jiǎn)蝹€(gè)堿性磷酸酶(ALP)催化其底物對(duì)氨基磷酸酚(p-APP)產(chǎn)生還原性的對(duì)氨基苯酚(p-AP)，p-AP可立即將Ag⁺還原成Ag⁰沉積到微電極表面，最后通過(guò)金屬溶出伏安法得到電信號(hào)。本發(fā)明利用軟光刻技術(shù)構(gòu)建了10×10彼此獨(dú)立的金微電極陣列，用于數(shù)字化分析的高通量平行實(shí)驗(yàn)。通過(guò)稀釋酶濃度和控制反應(yīng)液體積，保證每個(gè)微電極中至多含有單個(gè)酶分子，從而實(shí)現(xiàn)堿性磷酸酶的單分子檢測(cè)。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

(1)本發(fā)明將數(shù)字化分析與單分子電化學(xué)(SME)相結(jié)合，有效地提高了方法的可靠性和準(zhǔn)確性。

(2)與酶產(chǎn)物直接氧化信號(hào)相比，酶促金屬化可將信號(hào)增強(qiáng)約100倍，增強(qiáng)了信噪比，利于單分子電化學(xué)檢測(cè)。

(3)基于數(shù)字化分析，電信號(hào)被讀出為“0”或“1”，不用考慮具體的電流強(qiáng)度，有效地解決了SME的電流波動(dòng)和可靠性問(wèn)題，ALP檢出限從50aM降到1aM，并成功用于復(fù)雜體系肝癌細(xì)胞中ALP的檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1(A)為單分子電化學(xué)檢測(cè)堿性磷酸酶示意圖；圖1(B)為不同酶濃度下的電流強(qiáng)度：(a)酶促金屬化；(b)酶產(chǎn)物直接氧化；圖1(C)為不同酶濃度下金屬溶出伏安信號(hào)(0.05,0.2,0.5,0.7,1fM)。

圖2(A)為不同溶液組成下的電流溶出曲線：(a)ALP+p-APP；(b)AgNO₃+ALP；(c)AgNO₃+p-APP；(d)AgNO₃+p-APP+ALP；圖2(B)表示不同ALP濃度下的電流強(qiáng)度(0.001,0.01,0.02,0.05,0.1,0.15,0.2fM)。

圖3(A)為金微電極的掃描電鏡圖；圖3(B)為[Fe(CN)₆]^3-/4-在微電極表面的循環(huán)伏安圖；圖3(C)不同酶濃度下電流強(qiáng)度：(a)有納米金；(b)無(wú)納米金修飾的微電極陣列。

圖4(A)微電極陣列及電信號(hào)讀出為“0”或“1”示意圖；圖4(B-1)、圖4(B-2)、圖4(B-3)分別為1、5、10aM酶濃度下500個(gè)微電極的電流分布；圖4(C-1)、圖4(C-2)、圖4(C-3)分別為1、5、10aM酶濃度下實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)和泊松分布理論計(jì)算得到的概率分布(0,1,2,3個(gè)酶分子)比較圖；圖4(D-1)、圖4(D-2)、圖4(D-3)分別為1、5、10aM酶濃度下500個(gè)電信號(hào)通過(guò)MATLAB程序轉(zhuǎn)換為不同顏色的球。

圖5(A)為電信號(hào)與Ag⁺濃度的線性曲線；圖5(B)為Ag⁰量、電流強(qiáng)度隨沉積時(shí)間的變化曲線；圖5(C)為酶催化反應(yīng)的初始速度倒數(shù)與Ag⁺濃度倒數(shù)的線性曲線；圖5(D)為不同的單酶分子的電流時(shí)間曲線。

圖6(A)為每個(gè)微電極中平均酶分子數(shù)(AEM)與初始加入酶濃度的關(guān)系曲線(插圖為其相應(yīng)線性曲線)；圖6(B)為堿性磷酸酶檢測(cè)的特異性柱狀圖。

圖7(A)為肝癌細(xì)胞中堿性磷酸酶檢測(cè)示意圖；圖7(B-1)、圖7(B-2)分別為Hep G2和MCF-7細(xì)胞的500個(gè)電信號(hào)通過(guò)MATLAB程序轉(zhuǎn)換為不同顏色的球；圖7(C)為肝癌細(xì)胞中堿性磷酸酶檢測(cè)的特異性柱狀圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例僅用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。下面以堿性磷酸酶為例，對(duì)基于數(shù)字化單分子電化學(xué)檢測(cè)酶的方法進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。

實(shí)施例1

1、微電極陣列的制備

我們結(jié)合軟光刻的微加工方法制作了微電極陣列。采用ITO玻片作為基底，將其置于勻膠機(jī)上，旋涂AZ4620光刻膠(前轉(zhuǎn)600rpm，15s；后轉(zhuǎn)2000rpm，30s)，將ITO玻片置于75℃的烘臺(tái)上烘烤3min，然后置于105℃的烘臺(tái)上烘烤5min。待ITO玻片冷卻后采用設(shè)計(jì)有n個(gè)微電極條帶的微電極陣列圖案的菲林膠片作為掩膜，于17.4mw/cm²的紫外曝光強(qiáng)度下曝光40s，隨后采用顯影液(AZ400K:H₂O＝1：3)對(duì)ITO玻片進(jìn)行顯影，至曝光區(qū)光刻膠剛好去除干凈后采用超純水沖洗。然后將ITO玻片置于濃鹽酸中浸泡，洗掉ITO玻片上除光刻膠外其他部分的ITO膜，得到含10個(gè)100μm寬ITO條帶的微電極陣列，其中，每?jī)蓚€(gè)相鄰ITO條帶的間距約為3mm，用超純水沖洗，氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

將PDMS(交聯(lián)劑B與單體A質(zhì)量之比為1:10)澆注到硅片上，室溫下放置30min，待氣泡消除后置于75℃烘箱內(nèi)加熱2h進(jìn)行固化，切出PDMS塊，采用直徑為1mm的打孔器在每小塊PDMS上打100個(gè)通孔(10×10，與微電極陣列相對(duì)應(yīng))備用。

用無(wú)水乙醇將上述ITO玻片表面剩余的光刻膠完全洗去，并用piranha溶液((V(濃硫酸)：V(雙氧水)＝7:3))浸泡2min。將ITO玻片置于氯金酸溶液中，恒電位-0.1V(vs.Ag/AgCl)下靜置20秒，采用電沉積方法在ITO玻片上修飾納米金顆粒，得到含10個(gè)納米金條帶(帶寬均為100μm)的ITO玻片。最后將有100個(gè)孔的PDMS塊通過(guò)等離子體鍵合到含10個(gè)納米金條帶的ITO玻片表面，通孔與納米金條帶位置對(duì)齊，得到10×10彼此獨(dú)立的納米金微電極陣列。

2、單個(gè)堿性磷酸酶分子的檢測(cè)

先用pH 9.8 0.5M二乙醇胺溶液將ALP稀釋到20aM，然后與含1mM p-APP、100μM AgNO₃的溶液混合，得到預(yù)混反應(yīng)液；分別取出0.5μL預(yù)混反應(yīng)液滴加到納米金微電極陣列的每個(gè)小孔內(nèi)。通過(guò)控制預(yù)混反應(yīng)液中ALP濃度和每個(gè)小孔內(nèi)的加入體積，控制每個(gè)小孔內(nèi)約含有單個(gè)酶分子。37℃下反應(yīng)30min后，用超純水洗去小孔內(nèi)多余的銀離子及底物后，加入0.5M KCl溶液5μL，以Ag/AgCl絲作為對(duì)電極和參比電極，在-0.1V到0.2V范圍內(nèi)，100mV/s進(jìn)行線性伏安掃描(LSV)，得到銀的溶出伏安信號(hào)。每5個(gè)微電極陣列(共500個(gè)微電極，也可用10×50的微電極陣列)進(jìn)行一次平行實(shí)驗(yàn)，分別記錄不同酶濃度下500個(gè)微電極的電流分布，并且將實(shí)驗(yàn)得到的微電極的概率分布(含0、1、2或多個(gè)酶分子)與泊松分布理論計(jì)算結(jié)果比較，來(lái)證實(shí)數(shù)字化單分子酶檢測(cè)的可靠性和準(zhǔn)確性。

為了考察酶促金屬化的放大效率，分別取不同酶濃度的5μL二乙醇胺溶液(含有1mM p-APP)于微電極陣列表面，置于37℃下反應(yīng)30min后，通過(guò)LSV得到ALP的催化產(chǎn)物p-AP在電極表面的氧化信號(hào)，將p-AP的氧化信號(hào)與酶促金屬化的銀溶出信號(hào)進(jìn)行比較。

3、肝癌細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的高靈敏檢測(cè)

首先收集約10000個(gè)肝癌細(xì)胞于試管中，用超聲儀將細(xì)胞破碎后，10000rpm下離心10min，取上清液，用二乙醇胺適當(dāng)稀釋后，分別取0.5μL上清液(含有1mM p-APP，100μM AgNO₃)于500個(gè)微電極表面進(jìn)行酶促金屬化反應(yīng)。37℃下反應(yīng)30min后，500個(gè)微電極電信號(hào)讀出為“0”(不含酶分子)或“1”(至少含一個(gè)酶分子)?；诓此煞植己蛿?shù)字化分析，肝癌細(xì)胞內(nèi)ALP濃度可通過(guò)讀出為“0”的概率計(jì)算得到。

結(jié)果分析：

1、數(shù)字化放大的單分子檢測(cè)

目前，單分子檢測(cè)取得了較大進(jìn)展，但要檢測(cè)到單個(gè)分子的極少量電荷是很困難的。需要高效的信號(hào)放大策略去提高單位時(shí)間內(nèi)電子轉(zhuǎn)移數(shù)(1.6fA≈10⁴個(gè)電子每秒)。這里，數(shù)字化(EIM)的高效信號(hào)放大策略，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)堿性磷酸酶分子檢測(cè)，如圖1(A)。ALP催化其底物對(duì)氨基磷酸酚(p-APP)產(chǎn)生還原性的對(duì)氨基苯酚(p-AP)，p-AP可立即將Ag⁺還原成Ag⁰沉積到微電極表面。原因是p-AP和Ag⁺的半波電位(versus NHE)分別是0.097V和0.799V，通過(guò)合適的沉積時(shí)間，大量的Ag⁰沉積到電極表面，最后在KCl溶液中通過(guò)線性掃描伏安法(LSV)得到銀溶出信號(hào)。與酶產(chǎn)物p-AP的直接氧化信號(hào)相比，EIM可將信號(hào)增強(qiáng)約100倍，如圖1(B)。其主要原因?yàn)椋?1)EIM和LSV的結(jié)合可雙重放大電信號(hào)，提高信噪比；(2)ALP可快速催化底物分子的反應(yīng)，及相應(yīng)的銀沉積過(guò)程；(3)EIM可有效抑制底物從電極表面的擴(kuò)散，富集大量Ag⁰在電極表面；(4)修飾了納米金的微電極陣列可提高EIM反應(yīng)，并且納米金顆粒可作為銀沉積的種子，避免銀沉積對(duì)酶活性的影響。如圖1(C)，當(dāng)ALP濃度低至0.05fM時(shí)，仍可測(cè)得穩(wěn)定的電流信號(hào)，為單分子電化學(xué)檢測(cè)提供了可能。

在單分子電化學(xué)中，背景是必須要考慮的問(wèn)題。如圖2(A)，在ALP與p-APP(a)，AgNO₃與ALP(b)，或AgNO₃與p-APP(c)存在下，幾乎無(wú)電流信號(hào)，表明p-APP或ALP單獨(dú)存在下不會(huì)將Ag⁺還原成Ag⁰。只有當(dāng)AgNO₃、ALP和p-APP同時(shí)存在時(shí)，才得到很強(qiáng)的溶出信號(hào)，且明顯高于背景信號(hào)，表明了單分子電化學(xué)檢測(cè)ALP的可行性和特異性。

然而，當(dāng)ALP濃度稀釋到單分子水平時(shí)，每個(gè)微電極內(nèi)多一個(gè)或少一個(gè)酶分子，會(huì)給酶的放大效率以及電信號(hào)帶來(lái)較大影響。此外，酶分子間的異質(zhì)性進(jìn)一步影響電流的穩(wěn)定性，限制了單分子電化學(xué)在實(shí)際應(yīng)用中的準(zhǔn)確性和可靠性。如圖2(B)，當(dāng)ALP濃度低于0.05fM時(shí)，電流的變化出現(xiàn)大的波動(dòng)，并且只有一部分微電極得到可測(cè)的電流信號(hào)。

2、微電極陣列的特性

歸因于微電極的尺寸小、背景低、靈敏度高、響應(yīng)快、時(shí)空分辨率高等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)廣泛用于單細(xì)胞和單分子檢測(cè)中。在這里，為了實(shí)現(xiàn)數(shù)字化單分子分析中高通量平行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)軟光刻技術(shù)構(gòu)建了一種10×10彼此獨(dú)立的、活性均勻的微電極陣列。因?yàn)榻鹂梢哉T導(dǎo)銀沉積，采用金微電極作為檢測(cè)電極進(jìn)行銀沉積，不僅能加速銀的還原反應(yīng)，而且有利于銀沉積到檢測(cè)電極表面進(jìn)行溶出伏安分析。利用簡(jiǎn)單的電沉積，于氯金酸溶液中在ITO玻片表面制備了修飾了納米金的微電極陣列。由其掃描電鏡(SEM)圖可清楚地看到玻片表面成功修飾的金納米顆粒(圖3(A))。于0.5mM[Fe(CN)₆]^3-/4-中的循環(huán)伏安如圖3(B)，可見(jiàn)微電極間的電活性比較均一，適用于高通量平行實(shí)驗(yàn)。此外，與未修飾納米金的ITO微電極比，修飾了納米金的微電極可將電信號(hào)增強(qiáng)約3倍(圖3(C))，利于單分子酶電化學(xué)檢測(cè)。

3、結(jié)合數(shù)字化分析提高單分子電化學(xué)的可靠性

數(shù)字化分析的結(jié)合可有效地解決單分子電化學(xué)的電流波動(dòng)和可靠性問(wèn)題，由于電信號(hào)被讀出為“0”(不含酶分子)或“1”(至少含一個(gè)酶分子)，不再考慮電流的具體強(qiáng)度，并且目標(biāo)物濃度可通過(guò)“0”的概率計(jì)算得到，如圖4(A)。無(wú)酶時(shí)，通過(guò)500個(gè)微電極的電信號(hào)分布，測(cè)得背景電流約2nA。低ALP濃度下，為了避免電流波動(dòng)造成的影響，電信號(hào)被讀出為“0”或“1”。將稀釋的酶溶液隨機(jī)加入微電極中，每個(gè)微電極中會(huì)隨機(jī)分布0、1、2或多個(gè)酶分子，而其相應(yīng)概率可由泊松分布公式：計(jì)算得到，其中x代表分子數(shù)，λ表示每個(gè)微電極中平均酶分子數(shù)。當(dāng)酶濃度為1、5和10aM時(shí)，λ分別為0.05、0.25和0.5。例如，當(dāng)λ＝1時(shí)，含0或1個(gè)酶分子概率為e^-1＝0.368；含2個(gè)酶分子概率為e^-1/2＝0.184；含3個(gè)酶分子概率為e^-1/6＝0.08。

繪制不同酶濃度下500個(gè)微電極的電流分布，如圖4(B-1)-圖4(B-3)，每個(gè)酶濃度下都出現(xiàn)了很大的電流波動(dòng)。但是含1、2或多個(gè)酶分子的概率隨著酶濃度增加而增加。因此，500個(gè)微電極可由其電信號(hào)為1.8±1.0、8.0±1.0、11.7±1.5和15.8±1.5nA劃分為四部分，分別含0、1、2和多個(gè)酶分子。其中1.8nA代表背景電流，8nA表示單個(gè)酶分子的電信號(hào)。如圖4(C-1)-圖4(C-3)，實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)得到的酶分布情況與泊松分布理論計(jì)算結(jié)果吻合較好，表明數(shù)字化分析單分子電化學(xué)檢測(cè)ALP的可靠性和準(zhǔn)確性。為了簡(jiǎn)化統(tǒng)計(jì)過(guò)程，500個(gè)電信號(hào)通過(guò)MATLAB程序轉(zhuǎn)換成多色球，如圖4(D-1)-圖4(D-3)，可簡(jiǎn)單的通過(guò)統(tǒng)計(jì)暗球和亮球個(gè)數(shù)來(lái)計(jì)算“0”或“1”的概率。

4、單個(gè)堿性磷酸酶分子的動(dòng)力學(xué)表征

首先，足夠的ALP、p-APP和沉積時(shí)間保證Ag⁺充分還原成Ag⁰，從而繪制了Ag⁺濃度與電信號(hào)的線性曲線，如圖5(A)。單分子酶條件下，電信號(hào)隨著沉積時(shí)間增加而增加，且電極表面Ag⁰沉積量可通過(guò)圖5(A)中標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。如圖5(B)，Ag⁰沉積量與電流隨沉積時(shí)間變化吻合較好，表明電信號(hào)是來(lái)自于酶促金屬化和金屬的溶出伏安信號(hào)，而非背景信號(hào)。此外，如圖5(C)，繪制了反應(yīng)速度的倒數(shù)與Ag⁺濃度倒數(shù)的線性曲線，由Lineweaver-Burk方程：?jiǎn)蝹€(gè)ALP的米氏常數(shù)(Km)計(jì)算得0.169mM，與常規(guī)實(shí)驗(yàn)的0.15mM具有可比性，表明單個(gè)酶分子仍對(duì)底物具有強(qiáng)的催化活性。最后，通過(guò)不同酶分子隨沉積時(shí)間的電流變化情況，證實(shí)了單個(gè)酶分子間的異質(zhì)性，如圖5(D)。

5、數(shù)字化單分子電化學(xué)檢測(cè)堿性磷酸酶

當(dāng)x＝0時(shí)，公式(1)可變形為：λ₀＝-lnP_x＝0(3)。進(jìn)而，酶濃度可由公式：計(jì)算得到，其中N_A表示阿伏伽德羅常數(shù)(6.02×10²³mol^-1)，V表示反應(yīng)液體積。如圖6(A)，每個(gè)微電極中平均酶分子數(shù)(AEM)隨加入的酶濃度的增加而增加，且由其插圖可知，從1aM到20aM的酶濃度下可得到好的線性曲線，且檢出限低至1aM，可認(rèn)為是ALP檢測(cè)中最靈敏的方法。因此，通過(guò)數(shù)字化分析的結(jié)合，ALP檢出限從50aM降低到1aM，提高了單分子電化學(xué)在實(shí)際應(yīng)用中的靈敏度和可靠性。

圖6(B)是用10pM葡萄糖、10pM尿素、20fM抗壞血酸及15fM凝血酶作為對(duì)照組所得到的微電極中酶分子數(shù)柱狀圖。從圖中可以看出實(shí)驗(yàn)組(含20aM ALP)明顯高于對(duì)照組，且當(dāng)干擾物濃度高于目標(biāo)物3-6個(gè)數(shù)量級(jí)時(shí)，實(shí)驗(yàn)組結(jié)果是對(duì)照組的20倍，證明該方法具有比較好的特異性。

6、肝癌細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶檢測(cè)

通過(guò)復(fù)雜體系中ALP的高靈敏檢測(cè)進(jìn)一步討論數(shù)字化單分子電化學(xué)檢測(cè)的可靠性和靈敏度。利用細(xì)胞破碎儀從裂解的肝癌細(xì)胞Hep G2和乳腺癌細(xì)胞MCF-7中提取出ALP溶液，在500個(gè)微電極陣列中實(shí)現(xiàn)數(shù)字化分析，如圖7(A)。通過(guò)MATLAB程序?qū)?00個(gè)電信號(hào)轉(zhuǎn)換成多色球，從而“0”的概率可簡(jiǎn)單地由暗球數(shù)目統(tǒng)計(jì)出來(lái)。如圖7(B-1)和圖7(B-2)，對(duì)于MCF-7細(xì)胞，幾乎無(wú)亮球，表明ALP分子很少，而Hep G2中檢測(cè)到較多ALP分子。其原因可能是ALP常作為臨床診斷中的標(biāo)志物，且血清中ALP的升高常與骨頭、肝臟等疾病有關(guān)。基于方程(3)和(4)，計(jì)算得到單個(gè)肝癌細(xì)胞內(nèi)ALP含量約為12.1aM，表明該方法可成功用于生物體系中ALP的檢測(cè)。

釩酸鈉(Na₃VO₄)是一種常用的ALP抑制劑。為了考察數(shù)字化單分子檢測(cè)在復(fù)雜體系中的選擇性和特異性，Hep G2+Na₃VO₄和MCF-7作為對(duì)照組。如圖7(C)，只有Hep G2細(xì)胞中檢測(cè)到明顯的ALP分子，表明該方法具有良好的特異性。

通過(guò)以上各項(xiàng)檢測(cè)，證明本發(fā)明可以很好地解決單分子電化學(xué)的可靠性問(wèn)題，推動(dòng)其在復(fù)雜體系中的實(shí)際應(yīng)用，而且該方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好，無(wú)需復(fù)雜儀器。本發(fā)明還可以推廣到其它單個(gè)生物分子、單細(xì)胞的檢測(cè)。