果需要較長的貯存期限，則優(yōu)選本發(fā)明的茚三酮試劑包含葡萄糖。
[0056]其它用作本發(fā)明茚三酮試劑的溫度依賴性還原劑的單糖包括諸如甘油醛和半乳糖的化合物，二者均為醛糖。發(fā)現(xiàn)能形成本發(fā)明溫度依賴性還原劑的非窮舉的單糖包括醛糖，核糖、木糖、赤蘚糖、蘇糖、來蘇糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖和L-甘油基-D-甘露庚糖，以及酮糖，二羥基丙酮、赤蘚酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖和景天庚酮糖(Sedoheptalose)。醛糖為在其線性形式下具有醛基的單糖，而酮糖為在其線性形式下具有酮基的單糖。
[0057]一般而言，一些二糖和多糖不具有形成所述測試方案和批次穩(wěn)定性測試所定義的合適的溫度依賴性還原劑所需的性能。對二糖而言，它們可為還原糖或非還原糖。例如，蔗糖為非還原二糖，且發(fā)現(xiàn)其在根據(jù)方案I和2評價時在茚三酮還原成還原茚三酮中不具有足夠的活性。然而，存在顯著數(shù)量的在其環(huán)狀形式下包含半縮醛基或半縮酮基的二糖和多糖。這些類型的糖能起方案I和2所定義的溫度依賴性還原劑的作用。二糖即乳糖和麥芽糖為兩個該類實例。
[0058]發(fā)現(xiàn)能形成本發(fā)明的溫度依賴性還原劑的非窮舉的二糖包括海藻糖(Trihalose)、纖維素二糖、曲二糖、黑曲霉二糖、異麥芽糖、槐糖、昆布二糖、龍膽二糖、土冉糖、麥芽酮糖、帕拉金糖、龍膽二酮糖、甘露二糖、蜜二糖、車前二塘、蕓香糖和木二糖。
[0059]較長鏈的多糖可為有效的溫度依賴性還原劑；四蔗糖即水蘇糖是一個該類實例。盡管長得多的鏈的多糖如淀粉是不合適的，然而部分水解的淀粉如糊精和麥芽糖糊精可為有效的溫度依賴性還原劑。應(yīng)理解的是盡管長鏈多糖可為合適的溫度依賴性還原劑，然而它們不是優(yōu)選的，因為它們可給出更粘稠的溶液且可提高沉淀的可能性。
[0060]溫度依賴性還原劑也可包括一種或多種羧酸和/或其鹽。一般而言，發(fā)現(xiàn)僅含一個羧酸基團(tuán)且不含其它官能團(tuán)的簡單單官能羧酸不能起方案I和2的溫度依賴性還原劑的作用。該類單官能羧酸包括乙酸、丙酸和苯甲酸。然而，發(fā)現(xiàn)甲酸及其鹽能起方案I和2的溫度依賴性還原劑的作用。
[0061]適用于溫度依賴性還原劑中的羧酸的鹽包括金屬鹽，特別是第I族和第II族金屬的鹽如鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽和鎂鹽。發(fā)現(xiàn)甲酸鈉(即甲酸的鈉鹽)分別根據(jù)方案I和方案2，在第二溫度下在茚三酮還原成還原茚三酮中具有足夠的活性，而在第一溫度下在茚三酮還原中不具有足夠的活性。特別地，發(fā)現(xiàn)甲酸鈉具有介于葡萄糖和果糖之間的還原活性。此外，貯存期限類似于具有超過4年的貯存期限的葡萄糖。
[0062]適于用作本發(fā)明溫度依賴性還原劑的其它羧酸和/或其鹽為包含至少一個額外還原性基團(tuán)如一個或多個羥基、酮基或醛基的那些。所述羧酸的合適鹽包括金屬鹽如周期表第I或II族金屬的鹽。合適鹽的實例包括鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽和鈣鹽。
[0063]優(yōu)選的羧酸具有1-24個碳原子，更優(yōu)選1-18個碳原子，仍更優(yōu)選1_12個碳原子，尤其優(yōu)選C1-CJf或酮。所述化合物可為直鏈的、支化的或者環(huán)狀的。
[0064]此外，已發(fā)現(xiàn)含有一個或多個醛基和酮基且存在或不存在羥基的化合物(包括簡單的醛和酮本身)滿足方案I和2的要求。該類優(yōu)選的化合物具有1-24個碳原子，更優(yōu)選
1-18個碳原子，仍更優(yōu)選1-12個碳原子，尤其優(yōu)選C1-CJf和酮。所述化合物可為直鏈的、支化的或者環(huán)狀的。合適醛和酮的實例包括丙酮。
[0065]溫度依賴性還原劑也可包括一種或多種無機(jī)化合物，條件是它們也滿足方案I和2的要求。特別地，低氧化態(tài)的無機(jī)硫化合物如亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽和/或包括低氧化態(tài)磷含氧酸如亞磷酸鹽和次磷酸鹽的無機(jī)化合物可能是特別合適的。例如，已發(fā)現(xiàn)亞磷酸(包括其亞磷酸鹽如鋰鹽、鈉鹽和鉀鹽)通過了方案I和2，其具有介于果糖和甲酸鈉之間的活性。
[0066]用于本發(fā)明茚三酮試劑中的溫度依賴性還原劑是本領(lǐng)域公知的，且可商購獲得或者可以以類似于已知合成路線的方式制備。
[0067]應(yīng)理解的是，上文未指出的其它化合物或化合物類別可能是適于用作本發(fā)明茚三酮試劑的溫度依賴性還原劑的組分，條件是它們滿足實施例1方案I和實施例2方案2 二者的要求。一般而言，除滿足方案I和方案2的要求之外，溫度依賴性還原劑應(yīng)易溶于水中或者與水混溶，且在與所述試劑的其它組分和/或所述分析方法中所用的或者產(chǎn)生的組分組合時不導(dǎo)致沉淀。還有利的是溫度依賴性還原劑是基本無毒的。
[0068]鑒于上文描述，茚三酮試劑可包含任何合適濃度的溫度依賴性還原劑。這根據(jù)所用的溫度依賴性還原劑，特別是根據(jù)諸如在第二溫度下的活性程度的因素而變化。溫度依賴性還原劑的濃度可為0.01-75% w/v或v/v。更優(yōu)選地，溫度依賴性還原劑的濃度為0.01-20% w/v或v/v。已發(fā)現(xiàn)在高于20% w/v或v/v的濃度下，所述試劑的組分更有可能從溶液中沉淀出，或者導(dǎo)致其它組分從溶液中沉淀出，因此優(yōu)選濃度低于20%。
[0069]當(dāng)制備用于分析方法中的茚三酮試劑時，溫度依賴性還原劑的起始濃度優(yōu)選類似于實施例1提供的方案I中的所指出的濃度，其能提供至少0.3的實際吸光度，更優(yōu)選
0.3-0.7的吸光度。更優(yōu)選地，由于重復(fù)實施例1的測試方案數(shù)次，每次提高溫度依賴性還原劑的百分比濃度，將提供0.6-0.7的最高吸光度而沒有從溶液中沉淀出或者不利影響所述茚三酮試劑的其它組分的濃度用作起始濃度。
[0070]本發(fā)明的茚三酮試劑進(jìn)一步包含茚三酮和含水緩沖劑。茚三酮和合適的含水緩沖劑均可商購獲得且用于現(xiàn)有茚三酮試劑中。
[0071]本發(fā)明的茚三酮試劑可包含任何合適量的茚三酮。優(yōu)選地，所述試劑中的茚三酮濃度為0.5-3% w/v O更優(yōu)選地，茚三酮的濃度為1-2.5% w/v O仍更優(yōu)選地且根據(jù)實施例1的方案I，所述試劑中的茚三酮濃度為約2% w/v?
[0072]可將任何合適的含水緩沖劑用于所述茚三酮試劑中。合適的緩沖劑是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選酸性緩沖劑。更優(yōu)選地，為了將PH保持在3-7、更優(yōu)選4-6、仍更優(yōu)選4.5-5.5的值下，優(yōu)選弱酸性緩沖劑。特別合適的pH值為約5.2。
[0073]所述緩沖劑可由任何弱酸及其一種共軛堿/鹽制備。所述酸可為有機(jī)酸或無機(jī)酸。優(yōu)選有機(jī)酸，其實例包括乙酸(acetic acid)、乙酸(ethanoic acid)和丙酸。一種優(yōu)選的組合是乙酸及其一種鹽。所述酸的鹽可為任何合適的鹽。所述鹽可由任何金屬陽離子形成。然而，優(yōu)選所述鹽由任一種堿金屬、特別是鋰、鈉或鉀形成。
[0074]如上所述，還原茚三酮不溶于完全水性的介質(zhì)中。有鑒于此，包商購的含還原茚三酮的茚三酮試劑無法在不存在顯著量的有機(jī)溶劑下制備或使用。然而，本發(fā)明的優(yōu)點在于所述茚三酮試劑無須包含有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的混合物。其結(jié)果是，生產(chǎn)成本得以降低，所述試劑對環(huán)境的危害更小且廢棄物的處理程序得以簡化。
[0075]有機(jī)溶劑在所述茚三酮試劑中的存在可影響所述試劑的功效。已發(fā)現(xiàn)不含有機(jī)溶劑的本發(fā)明一些實施方案的試劑的敏感度比包含有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑混合物的商購試劑的敏感度低約30%。此外，在不存在有機(jī)溶劑下，所得還原茚三酮的沉淀風(fēng)險可能更大。
[0076]盡管存在上述問題，然而在不使用有機(jī)溶劑配制時，本發(fā)明的試劑在用于氨基酸分析時提供了至少可接受的結(jié)果。此外，根據(jù)方案I和2優(yōu)化溫度依賴性還原劑的濃度使沉淀風(fēng)險降至最低。
[0077]在替代和優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的茚三酮試劑進(jìn)一步包含有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的混合物。通常用于商購試劑中的有機(jī)溶劑包括二甲亞砜、乙二醇、丙二醇、環(huán)丁砜、羥基醚如卡必醇、丙二醇單甲醚和甲基溶纖劑，以及簡單醇如甲醇，以單獨或混合物形式。有機(jī)溶劑的添加提高了本發(fā)明茚三酮試劑的敏感度。當(dāng)在色譜系統(tǒng)上使用優(yōu)選的茚三酮試劑時，應(yīng)考慮該因素，這將在下文更詳細(xì)地描述。
[0078]所用有機(jī)溶劑的總濃度根據(jù)所述有機(jī)溶劑的性質(zhì)而變化。特別地，所用有機(jī)溶劑的總濃度由10% v/v變化至75% v/v O更優(yōu)選地，所用有機(jī)溶劑的總濃度由25% v/v變化至65% v/vo仍更優(yōu)選地，所用有機(jī)溶劑的總濃度由35% v/v變化至55% v/v。盡管可使用任意上述商購有機(jī)溶劑，然而根據(jù)下文所示的色譜法實施例，本發(fā)明的方法優(yōu)選使用40-55% v/v 的乙二醇。
[0079]本發(fā)明的茚三酮試劑可根據(jù)用于檢測含氮化合物的已知和標(biāo)準(zhǔn)程序以及方法使用。用于該類方法中的茚三酮試劑為上文在本發(fā)明第一方面中定義的那些。因此，所述茚三酮試劑包含分別根據(jù)實施例1和2中提供的方案I和方案2在第一溫度下不具有活性、而在第二閾值溫度下具有將茚三酮還原以形成還原茚三酮的活性的溫度依賴性還原劑。
[0080]如前所述，本發(fā)明的茚三酮試劑必須在第一溫度下不具有活性，而在第二溫度下具有將茚三酮還原以形成還原茚三酮的活性，其中第二溫度高于第一溫度。由于其提高的穩(wěn)定性，本發(fā)明的茚三酮試劑可用作可視化試劑以識別和/或定量化寬范圍的含氮化合物。
[0081]然而，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的茚三酮試劑用于氨基酸分析，特別是在使用已知和標(biāo)準(zhǔn)氨基酸分析儀下。
[0082]因此，在第二方面中，本發(fā)明提供了茚三酮試劑在用于分析含氮化合物、特別是氨基酸等的方法中的用途，其中所述茚三酮試劑包含:
[0083]茚三酮；
[0084]含水緩沖劑；和
[0085]溫度依賴性還原劑，所述還原劑在第一溫度下在茚三酮還原中不具有活性，而在第二溫度下在茚三酮還原成還原茚三酮中具有活性，其中第二閾值溫度高于第一溫度。
[0086]所述茚三酮試劑可用于分析如識別和/定量化一種或多種含氮化合物的方法中。所述方法適于分析一系列含氮化合物。實際上，如上所述，所述方法可用于分析有機(jī)和無機(jī)含氮化合物二者。
[0087]所述茚三酮試劑可用于分析如識別和/定量化一種或多種含氮化合物的方法中。所述方法適于分析一系列含氮化合物。實際上，如上所述，所述方法可用于分析有機(jī)和無機(jī)含氮化合物二者。
[0088]本發(fā)明的方法特別適于分析氨基酸和由氨基酸形成的化合物如蛋白質(zhì)、肽等。下文說明描述了氨基酸的分析。應(yīng)理解的是，可以以類似方式處理上文所述的其它含氮化合物。
[0089]所述含氮化合物可存在于任何液體介質(zhì)或物流中。本發(fā)明的方法特別適于分析來自離子交換液相色譜程序中的含一種或多種氨基酸的離子交換柱出口的洗脫液。
[0090]本發(fā)明的方法可使用常規(guī)自動氨基酸分析儀進(jìn)行。如上所述，自動分析儀通常包括用于將氨基酸分離成其分別的組分的裝置、用于將茚三酮試劑引入系統(tǒng)中從而允許分離的氨基酸和茚三酮試劑在高溫下反應(yīng)以形成顯色物質(zhì)的輸入系統(tǒng)，和用于記錄所述顯色物質(zhì)在特定波長下的吸光度的裝置。以此方式可測定存在于測試樣品中的氨基酸和各自的相對濃度。