至其敏感度得以?xún)?yōu)化。這通過(guò)改變所述溫度依賴(lài)性還原劑的濃度和/或反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)。
[0137]起始濃度為發(fā)現(xiàn)滿(mǎn)足上述測(cè)試方案條件的濃度。如上所述，顯色室中的起始溫度可根據(jù)所用溫度依賴(lài)性還原劑變化，但優(yōu)選為125-135?。
[0138]對(duì)此處所示的色譜法實(shí)施例而言，將不同試劑組合物的相對(duì)敏感度根據(jù)甘氨酸的峰高(單位為mAU)進(jìn)行對(duì)比。因此，對(duì)于所有分析而言，停留時(shí)間和峰寬(即半高峰寬)的色譜條件是恒定的(參見(jiàn)下文的色譜條件)。
[0139]使用下述儀器條件:
[0140]色譜模式:恒溶劑
[0141]柱流量:0.45ml/分鐘
[0142]茚三酮試劑流量:0.30ml/分鐘
[0143]加熱反應(yīng)室溫度:可在125_135°C之間變化
[0144]反應(yīng)時(shí)間:60秒
[0145]注入體積:20 μ I
[0146]注入的甘氨酸量:2nmol
[0147]停留時(shí)間:5.0分鐘
[0148]半高峰寬:0.26分鐘
[0149]敏感度標(biāo)度:mAU(lmAU相當(dāng)于0.001吸光度)
[0150]實(shí)施例3.1—果糖
[0151]在上述條件下使用標(biāo)準(zhǔn)氨基酸分析儀評(píng)價(jià)包含0.20% w/v果糖作為溫度依賴(lài)性還原劑的茚三酮試劑的敏感度。
[0152]在存在40%乙二醇下，在131°C反應(yīng)溫度下識(shí)別的峰高為112mAU。
[0153]在不存在乙二醇下，包含0.20% w/v果糖的茚三酮試劑在132°C反應(yīng)溫度下提供了 88mAU的峰高。
[0154]實(shí)施例3.2—甲酸鈉
[0155]在上述條件下使用標(biāo)準(zhǔn)氨基酸分析儀評(píng)價(jià)包含I % w/v甲酸鈉作為溫度依賴(lài)性還原劑的茚三酮試劑的敏感度。
[0156]在存在40 %乙二醇下，包含I % w/v甲酸鈉的茚三酮試劑在133°C反應(yīng)溫度下提供了 126mAU的峰高。
[0157]在不存在乙二醇下，包含I % w/v甲酸鈉的茚三酮試劑在133°C反應(yīng)溫度下提供了107mAU的峰高。
[0158]實(shí)施例3.3—葡萄糖
[0159]在上述條件下使用標(biāo)準(zhǔn)氨基酸分析儀評(píng)價(jià)包含2% w/v葡萄糖作為溫度依賴(lài)性還原劑的茚三酮試劑的敏感度。
[0160]在存在40%乙二醇下，包含2% w/v葡萄糖的茚三酮試劑在131 °C反應(yīng)溫度下提供了 97mAU的峰高。
[0161]在不存在乙二醇下，包含2% w/v葡萄糖的茚三酮試劑在133°C反應(yīng)溫度下提供了79mAU的峰高。
[0162]上述結(jié)果表明，活性從葡萄糖到甲酸鈉到果糖具有很大的提高，如對(duì)葡萄糖和果糖獲得類(lèi)似敏感度所需的百分比濃度所示(分別從2% w/v變化至0.2% w/v)。因此，預(yù)期獲得期望敏感度所需的百分比濃度根據(jù)用于形成溫度依賴(lài)性還原劑的化合物變化。在用于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸分析儀上時(shí)，諸如溫度依賴(lài)性還原劑的百分比濃度、有機(jī)溶劑的百分比濃度(如果有的話(huà))和反應(yīng)室溫度的因素的優(yōu)化確定了對(duì)于所有通過(guò)方案I和2的化合物的最佳百分比濃度。
[0163]此外，所述結(jié)果表明，在不存在有機(jī)溶劑下，溫度依賴(lài)性還原劑的敏感度降低。然而，可看出該活性降低不顯著影響分析方法的敏感度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于分析含氮化合物的方法中的茚三酮試劑，所述茚三酮試劑包含: 茚三酮； 含水緩沖劑；和 溫度依賴(lài)性還原劑，所述還原劑在第一溫度下在茚三酮還原中不具有活性，而在第二溫度下在茚三酮還原成還原茚三酮中具有活性，其中第二溫度高于第一溫度。2.根據(jù)權(quán)利要求1的茚三酮試劑，其中所述試劑基本上不含還原茚三酮。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的茚三酮試劑，其中第二溫度為至少100°C。4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑為滿(mǎn)足實(shí)施例I方案I的在第二溫度下的還原活性標(biāo)準(zhǔn)的化合物。5.根據(jù)權(quán)利要求4的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑為滿(mǎn)足方案I的在第二溫度下的還原活性標(biāo)準(zhǔn)的化合物，由此觀察到0.4的最低吸光度。6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的茚三酮試劑，其中第一溫度為0-30°C。7.根據(jù)權(quán)利要求6的茚三酮試劑，其中第一溫度為5-25°C。8.根據(jù)權(quán)利要求7的茚三酮試劑，其中第一溫度為10-20°C。9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑為滿(mǎn)足實(shí)施例2方案2的在第一溫度下的還原活性標(biāo)準(zhǔn)的化合物。10.根據(jù)權(quán)利要求9的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑為在3個(gè)月后活性為其初始活性的至少50%的化合物。11.根據(jù)權(quán)利要求10的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑為在6個(gè)月后活性為其初始活性的至少50%的化合物。12.根據(jù)權(quán)利要求11的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑為在12個(gè)月后活性為其初始活性的至少50%的化合物。13.根據(jù)權(quán)利要求12的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑為在24個(gè)月后活性為其初始活性的至少50%的化合物。14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑包括一種或多種糖。15.根據(jù)權(quán)利要求14的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑包括一種或多種單糖。16.根據(jù)權(quán)利要求15的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑包括葡萄糖、果糖、甘油醛、半乳糖、核糖、木糖、赤蘚糖、蘇糖、來(lái)蘇糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖和L-甘油基-D-甘露庚糖、二羥基丙酮、赤蘚酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、山梨糖、塔格糖、景天庚酮糖(Sedoheptalose)或它們的混合物。17.根據(jù)權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑包括一種或多種二糖。18.根據(jù)權(quán)利要求17的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑包括乳糖、麥芽糖、海藻糖(Trihalose)、纖維素二糖、曲二糖、黑曲霉二糖、異麥芽糖、槐糖、昆布二糖、龍膽二糖、土冉糖、麥芽酮糖、帕拉金糖、龍膽二酮糖、甘露二糖、蜜二糖、車(chē)前二塘、蕓香糖、木二糖或它們的混合物。19.根據(jù)權(quán)利要求14-18中任一項(xiàng)的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑包括一種或多種較長(zhǎng)鏈的多糖。20.根據(jù)權(quán)利要求19的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑包括水蘇糖、糊精、麥芽糖糊精或它們的混合物。21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑包括一種或多種羧酸和/或其鹽。22.根據(jù)權(quán)利要求21的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑包括羧酸的第I族或第II族金屬的鹽。23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑包括一種或多種單官能羧酸或其鹽。24.根據(jù)權(quán)利要求23的茚三酮試劑，其中所述羧酸為甲酸或其鹽。25.根據(jù)權(quán)利要求21-24中任一項(xiàng)的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑包括一種或多種包含至少一個(gè)額外還原性基團(tuán)的羧酸。26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑包括一種或多種具有一個(gè)或多個(gè)醛基和/或酮基的化合物。27.根據(jù)權(quán)利要求26的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑包括丙酮。28.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑包括一種或多種無(wú)機(jī)化合物。29.根據(jù)權(quán)利要求28的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑包括低氧化態(tài)的無(wú)機(jī)硫化合物和/或低氧化態(tài)磷含氧酸。30.根據(jù)權(quán)利要求29的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑包括亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽、亞磷酸鹽和/或次磷酸鹽。31.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑的濃度為0.01-75% w/v 或 v/vo32.根據(jù)權(quán)利要求31的茚三酮試劑，其中所述溫度依賴(lài)性還原劑的濃度為0.01-20%w/v 或 v/v033.根據(jù)權(quán)利要求32的茚三酮試劑，其中所述茚三酮試劑中的茚三酮濃度為0.5-3%w/v 或 v/v034.根據(jù)權(quán)利要求33的茚三酮試劑，其中所述茚三酮試劑中的茚三酮濃度為1-2.5%w/v 或 v/v035.根據(jù)權(quán)利要求34的茚三酮試劑，其中所述茚三酮試劑中的茚三酮濃度為約2%w/V 或 v/v036.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的茚三酮試劑，其中所述緩沖劑為含水緩沖劑。37.根據(jù)權(quán)利要求36的茚三酮試劑，其中所述緩沖劑包含弱酸及其一種共軛堿/鹽。38.根據(jù)權(quán)利要求37的茚三酮試劑，其中所述緩沖劑包含有機(jī)酸。39.根據(jù)權(quán)利要求38的茚三酮試劑，其中所述緩沖劑包含乙酸(aceticacid)、乙酸(ethanoic acid)或丙酸。40.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的茚三酮試劑，其中所述緩沖劑保持3-7的pH值。41.根據(jù)權(quán)利要求40的茚三酮試劑，其中所述緩沖劑保持4-6的pH值。42.根據(jù)權(quán)利要求41的茚三酮試劑，其中所述緩沖劑保持4.5-5.5的pH值。43.根據(jù)權(quán)利要求42的茚三酮試劑，其中所述緩沖劑保持約5.2的pH值。44.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的茚三酮試劑，進(jìn)一步包含一種或多種有機(jī)溶劑。45.根據(jù)權(quán)利要求44的茚三酮試劑，其中所述有機(jī)溶劑選自二甲亞砜、乙二醇、丙二醇、環(huán)丁砜、卡必醇、丙二醇單甲醚、甲基溶纖劑和甲醇。46.根據(jù)權(quán)利要求44或45的茚三酮試劑，其中有機(jī)溶劑的濃度為10-75%v/v?47.根據(jù)權(quán)利要求46的茚三酮試劑，其中有機(jī)溶劑的濃度為25-65%v/v?48.根據(jù)權(quán)利要求47的茚三酮試劑，其中有機(jī)溶劑的濃度為35-55%v/v?49.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的茚三酮試劑在分析含氮化合物的方法中的用途。50.根據(jù)權(quán)利要求48的用途，其中所述含氮化合物為氨基酸。51.一種分析含氮化合物的方法，所述方法包括: i)提供根據(jù)權(quán)利要求1-48中任一項(xiàng)的茚三酮試劑； ?)將所述茚三酮試劑加熱至至少第二溫度，從而形成含還原茚三酮的混合物；和 iii)使所述含還原茚三酮的混合物與所述含氮化合物接觸。52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述含氮化合物為氨基酸。53.根據(jù)權(quán)利要求51或52的方法，進(jìn)一步包括分析步驟(iii)產(chǎn)物的顏色。
【專(zhuān)利摘要】提供了一種用于通過(guò)顯色反應(yīng)分析含氮化合物、特別是使含氮化合物可視化的方法中的茚三酮試劑，所述茚三酮試劑包含茚三酮、含水緩沖劑，和溫度依賴(lài)性還原劑，所述還原劑在第一溫度下在茚三酮還原中不具有活性，而在第二溫度下在茚三酮還原成還原茚三酮中具有活性，其中第二溫度高于第一溫度。所述試劑特別可用于分析氨基酸。
【IPC分類(lèi)】G01N33/68
【公開(kāi)號(hào)】CN104919320
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380070451
【發(fā)明人】L·J·皮特斯, M·G·帕洛特, P·瓊斯
【申請(qǐng)人】Jpp色譜有限公司
【公開(kāi)日】2015年9月16日
【申請(qǐng)日】2013年11月20日
【公告號(hào)】DE202013010433U1, EP2735877A1, US20140141519, WO2014080158A1