[0091]通常使用基于尺寸、溶解性、電荷和/或結(jié)合親和性識(shí)別的技術(shù)分離氨基酸。目前，最常用于分離氨基酸的技術(shù)基于凈電荷識(shí)別，且因此稱為離子交換色譜法。本發(fā)明提供了一種方法，其可有效地與離子交換色譜法以及其它形式的色譜分離技術(shù)、柱和板聯(lián)用，包括但不限于凝膠過濾色譜法、親和色譜法和高壓或低壓液相色譜法，其中涉及正相、反相和吸附分離機(jī)理。此外，本發(fā)明提供了一種可與非色譜分離技術(shù)如柱電泳法聯(lián)用的方法。此夕卜，所述試劑可有效地用于并非必須包括色譜分離的技術(shù)如指紋可視化和管或容器中的顯色。
[0092]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明用作離子交換色譜程序的一部分，包括使含氨基酸的溶液通過樹脂填充的離子交換柱，從而通過其沿柱向下的迀移速率差異而將氨基酸樣品分離成分別的氨基酸組分。然后洗脫的氨基酸自由地與顯色溶液根據(jù)本發(fā)明的方法反應(yīng)。
[0093]如上所述，所述顯色溶液包含茚三酮、在第一溫度下不具有活性而在第二閾值溫度下具有將茚三酮還原以形成還原茚三酮的活性的溫度依賴性還原劑、乙酸鹽緩沖劑和優(yōu)選的有機(jī)溶劑。
[0094]上述茚三酮試劑適于用于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸分析儀上。如上所述，現(xiàn)有的氨基酸分析儀包括一個(gè)加熱反應(yīng)室。這也稱為顯色室，因?yàn)檫@是在將分離柱流出物與所述茚三酮試劑混合后產(chǎn)生Ruhemann紫的場(chǎng)所。
[0095]優(yōu)選對(duì)顯色室的溫度和/或溫度依賴性還原劑的濃度加以選擇以避免所得還原茚三酮沉淀。顯色室中的溫度可根據(jù)所用的溫度依賴性還原劑及其能在較高溫度下將茚三酮還原的程度而變化。然而，顯色室的溫度通常優(yōu)選為50-150°C，更優(yōu)選為80-150°C。仍更優(yōu)選地，顯色室的溫度為120-140°C。仍進(jìn)一步優(yōu)選地，顯色室的溫度為125-135°C。
[0096]將所述茚三酮試劑和洗脫的氨基酸在加熱反應(yīng)室中加熱并允許反應(yīng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間如15秒鐘至5分鐘。更優(yōu)選地，使所述茚三酮試劑和洗脫的氨基酸在加熱反應(yīng)室中反應(yīng)30秒鐘至2分鐘，更優(yōu)選約I分鐘。本發(fā)明茚三酮試劑的優(yōu)點(diǎn)在于在反應(yīng)室中產(chǎn)生所需顯色所需的時(shí)間短。
[0097]如上所述，本發(fā)明茚三酮試劑的組分僅在加熱時(shí)才反應(yīng)，從而產(chǎn)生還原茚三酮，所述還原茚三酮可與氨基酸接觸，從而產(chǎn)生用于光度分析的顯色產(chǎn)物。在本發(fā)明的方法中，將所述茚三酮試劑的組分在加熱顯色反應(yīng)室(通常為盤管)中加熱。在顯色反應(yīng)盤管剛開始處，還原茚三酮以極低的濃度形成，且還原茚三酮的濃度隨時(shí)間提高，這是因?yàn)樗鲈噭┏掷m(xù)暴露于高溫下。以此方式，本發(fā)明的茚三酮試劑可用于商購(gòu)分析儀上，而無需改變其構(gòu)成部件或操作方法。
[0098]可以以下文所述的多種不同方式將所述茚三酮試劑的組分引入顯色反應(yīng)室中。
[0099]在第一實(shí)施方案中，將茚三酮、上文所述的溫度依賴性還原劑、緩沖劑和任選的一種或多種有機(jī)溶劑預(yù)混以形成均勻溶液。所述均勻溶液為本發(fā)明第一方面的茚三酮試劑。這是優(yōu)選的實(shí)施方案，因?yàn)樗龌旌衔锟稍谄溆糜诒景l(fā)明方法中之前很好地形成。
[0100]更優(yōu)選地，在氨基酸分析程序中，借助一個(gè)或多個(gè)泵將所述混合物從一個(gè)或多個(gè)容器或儲(chǔ)罐中抽出并在任何方便的點(diǎn)處輸送至公共區(qū)域中。所述區(qū)域位于離子交換柱的下游，但位于顯色反應(yīng)室的上游。該設(shè)置是一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，因?yàn)樯藤?gòu)分析儀通常以此方式輸送包含還原茚三酮的茚三酮試劑。因此，本發(fā)明的茚三酮試劑可用于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸分析儀上，而無需改變其構(gòu)成部件或其操作方法。
[0101]仍更優(yōu)選地，所述區(qū)域位于顯色反應(yīng)室中。以此方式，在顯色反應(yīng)室中加熱時(shí)立即形成還原茚三酮。
[0102]在替代的實(shí)施方案中，所述茚三酮試劑的組分保持分開，直至加熱和與氨基酸接觸之前不久。例如，可借助兩個(gè)或更多的泵將茚三酮和溫度依賴性還原劑從一個(gè)或單獨(dú)的容器或儲(chǔ)罐中抽出并輸送至公共管線或混合區(qū)中，其中將它們組合，從而形成混合物。在該實(shí)施方案中，可各自從一個(gè)或單獨(dú)的容器或儲(chǔ)罐中抽出緩沖劑和任選的一種或多種有機(jī)溶劑，以與茚三酮和在室溫下不具有活性的化合物的混合物組合。
[0103]類似地，所述公共管線或混合區(qū)通常位于離子交換柱的下游，但位于顯色反應(yīng)室的上游。該設(shè)置是優(yōu)選的，因?yàn)樯藤?gòu)分析儀通常以此方式輸送包含還原茚三酮的茚三酮試劑。因此，本發(fā)明的茚三酮試劑可用于標(biāo)準(zhǔn)氨基酸分析儀上，而無需改變其構(gòu)成部件或其操作方法。
[0104]還更優(yōu)選地，所述區(qū)域位于顯色反應(yīng)室中。以此方式，在顯色反應(yīng)室中加熱時(shí)立即形成還原茚三酮。
[0105]可使氨基酸物流在所述程序中任何方便的點(diǎn)處與組分或組分的混合物接觸。例如，可在形成混合物并加熱之前，將氨基酸與茚三酮或溫度依賴性還原劑之一組合。作為替代方案，可在加熱前使氨基酸與茚三酮和溫度依賴性還原劑的混合物組合。作為另一替代方案，可在混合和加熱發(fā)生以及形成還原茚三酮之后，使氨基酸與所述試劑的組分組合。
[0106]如上所述，通過使用方案I和2識(shí)別了一系列溫度依賴性還原劑，其在第一溫度下不具有活性，而在第二閾值溫度下具有將茚三酮還原成還原茚三酮的活性。現(xiàn)在在下文實(shí)施例中描述本發(fā)明的方案1、方案2和實(shí)施方案。
實(shí)施例
[0107]實(shí)施例1:方案I
[0108]本發(fā)明的方案I包括如下步驟:
[0109]I)制備下述溶液:
[0110]i) IM乙酸鋰、乙酸鈉或乙酸鉀/乙酸含水緩沖劑，pH為5.2，含有2% w/v茚三酮和所選起始濃度(w/v或v/v)的化合物X。優(yōu)選從0.01 % w/v或v/v起始，分階段逐步增大濃度。高濃度的水溶性固體或液體(特別是達(dá)到50%和更高)由于制備后或者在用于分析系統(tǒng)上時(shí)的溶解性問題或其它不利影響而可能難以評(píng)價(jià)。
[0111]ii)在純水中濃度為1.0mM的標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液。如前所述，選擇甘氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)參比氨基酸。
[0112]2)在測(cè)量接近15cm長(zhǎng)和1.5cm外徑的玻璃試管中添加2.0ml上述溶液i)、0.20ml標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液ii)和2.8ml純水。
[0113]3)將所述試管置于100°C的液體加熱浴中，保持不受干擾20分鐘。取出試管并快速冷卻至室溫。
[0114]4)將冷卻的溶液轉(zhuǎn)移至Icm比色杯中，并使用標(biāo)準(zhǔn)分光光度計(jì)或者比色計(jì)測(cè)量在570nm下相對(duì)于純水的吸光度。
[0115]5)在試劑中存在氨基酸或胺雜質(zhì)的情況下，在評(píng)價(jià)化合物活性的同時(shí)，還應(yīng)實(shí)施空白樣品。程序與上文2)相同，不同之處在于不使用甘氨酸標(biāo)樣且純水的量升至3.0ml。然后根據(jù)上文4)測(cè)量570nm下的吸光度。
[0116]6)通過從甘氨酸標(biāo)樣吸光度中減去空白樣品的吸光度，獲得由所述化合物在評(píng)價(jià)中產(chǎn)生的實(shí)際吸光度(下文稱為校正吸光度)。
[0117]由于化合物X的活性程度未知，優(yōu)選重復(fù)上述方案的方法許多次，每次逐步提高化合物X的濃度。提高化合物X的濃度，直至校正吸光度降至0.6-0.7。當(dāng)使用甘氨酸作為對(duì)照時(shí)，可能的最大校正吸光度為0.75-0.80，因此在該方案的評(píng)價(jià)中，如果獲得0.6-0.7的校正吸光度，則通過進(jìn)一步提高所述化合物的濃度不能必然獲得益處。
[0118]如果校正吸光度從來不超過0.30，則這表明化合物X不具有用于本發(fā)明茚三酮試劑中所需程度的活性。
[0119]如果校正吸光度降至低于0.30，而提高化合物X的濃度導(dǎo)致其從溶液中沉淀出或者導(dǎo)致一些其它不利影響，則這表明化合物X不具有用于本發(fā)明茚三酮試劑中所需的性會(huì)K。
[0120]實(shí)施例2:方案2
[0121]如果化合物X在高溫下具有足夠的活性，從而滿足上文實(shí)施例1中所述方案I的要求，則可使用下述測(cè)試來評(píng)價(jià)包含化合物X的茚三酮試劑在室溫下且在空氣存在下的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
[0122]以類似于實(shí)施例1方案I的方式制備茚三酮試劑，并在室溫下在空氣存在下儲(chǔ)存。以設(shè)定的時(shí)間間隔從所述茚三酮試劑中取樣，與氨基酸溶液混合，并加熱至100°c達(dá)設(shè)定的時(shí)間。以吸光度值測(cè)量所產(chǎn)生的Ruhemann紫的量(如果有的話)。相繼樣品中的顯色強(qiáng)度(吸光度)的降低速率表明了化合物X的長(zhǎng)期穩(wěn)定性是否足以形成本發(fā)明茚三酮試劑的一部分。
[0123]根據(jù)方案1，使用甘氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，因?yàn)闊o論使用何種試劑，其它氨基酸和胺化合物的相對(duì)敏感度都是類似的。
[0124]本發(fā)明的方案2包括如下步驟:
[0125]I)在第一天制備下述溶液:
[0126]i)甘氨酸于水中的1.0mM標(biāo)準(zhǔn)溶液；
[0127]ii)包含pH值為5.2的IM乙酸鋰、乙酸鈉或乙酸鉀/乙酸含水緩沖劑的茚三酮試劑，其包含2% w/v茚三酮和所選濃度(w/v或v/v)的化合物X?；衔颴的濃度優(yōu)選與在方案I中作為獲得0.4-0.7校正吸光度時(shí)的濃度所確定的類似。250ml的試劑應(yīng)為足以持續(xù)穩(wěn)定性測(cè)試的全程的體積。
[0128]2)在第一天，在標(biāo)準(zhǔn)試管中依次添加2.0ml茚三酮試劑(ii)、0.20ml甘氨酸標(biāo)樣
(i)和2.8ml純水。混合并將所述試管置于100°C的液體加熱浴中，并保持不受干擾35分鐘。取出試管并快速冷卻至室溫。在吸光光度計(jì)中在570nm下使用Icm程長(zhǎng)的流動(dòng)池測(cè)量該試管溶液相對(duì)于純水的吸光度。
[0129]3)在第一天，制備空白試管樣品，其包含2.0ml試劑(ii)和3.0ml純水。這計(jì)入了可存在于用于組成所述試劑的組分中的任何氨基酸或胺類雜質(zhì)?；旌喜⒃摽瞻自嚬苤糜?00°C的加熱浴中，保持不受干擾20分鐘。取出試管并快速冷卻至室溫。在吸光光度計(jì)中在570nm下使用Icm程長(zhǎng)的流動(dòng)池測(cè)量該試管溶液相對(duì)于純水的吸光度。
[0130]4)在第一天，計(jì)算由化合物X產(chǎn)生的校正吸光度。這通過從甘氨酸樣品吸光度中減去空白樣品的吸光度而獲得，如實(shí)施例1的方案I中所述。
[0131]5)在第一天，在完成步驟1-4之后，將所述試劑儲(chǔ)存在20°C下黑暗中具有塞子的瓶中并暴露于空氣中。這通過留出與瓶中試劑體積大致相同的大氣隙實(shí)現(xiàn)。
[0132]6)每隔2-4周，對(duì)所述試劑取樣并重復(fù)步驟2和3。每次根據(jù)步驟4計(jì)算570nm下的校正吸光度并將其與第一天獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。
[0133]實(shí)施例3—色譜法實(shí)施例
[0134]使用標(biāo)準(zhǔn)氨基酸分析儀評(píng)價(jià)許多包含不同溫度依賴性還原劑的茚三酮試劑的相對(duì)敏感度。根據(jù)所述測(cè)試方案和批次穩(wěn)定性測(cè)試，使用甘氨酸作為參比氨基酸。
[0135]如上所述，本發(fā)明的茚三酮試劑可任選包含有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的混合物。因此，出于對(duì)比的原因，在存在和不存在有機(jī)溶劑中兩種情況下評(píng)價(jià)這些茚三酮試劑的相對(duì)敏感度。如上所述，如果使用有機(jī)溶劑，則總濃度根據(jù)所用有機(jī)溶劑的性質(zhì)從35%變化至55%。在這些實(shí)驗(yàn)中，均在存在40%乙二醇下評(píng)價(jià)溫度依賴性還原劑。
[0136]就各個(gè)溫度依賴性還原劑而言，進(jìn)行色譜法實(shí)驗(yàn)數(shù)次，直