一種檢測試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體設(shè)及一種檢測試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED)是由冠狀病毒科 (Coronaviridae)冠狀病毒屬（Coronavirus)的豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus, P抓V)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，W嘔吐、水樣腹瀉、脫水為特 征，各年齡段豬均易感，其中哺乳仔豬、架子豬或育肥豬感染后的發(fā)病率可達100%，尤其W 哺乳仔豬受害最為嚴(yán)重。近年，自2010年冬季，豬流行性腹瀉在我國的大部分地區(qū)爆發(fā)流 行，之后相繼在韓國、日本、臺灣等地區(qū)也大范圍爆發(fā)此病。2013年上半年在北美地區(qū)也爆 發(fā)此病，并迅速傳播，給全球的養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的損失。
[0003] 豬傳染性胃腸炎（porcine transmissble gastroenteritis,TGE)是由冠狀病毒 科（Coronaviridae)冠狀病毒屬（Coronavirus)的傳染性胃腸炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus ,TGEV)引起的W豬嘔吐、腹瀉、脫水為特征的傳染 病，能感染不同年齡段和品種的豬，對新生仔豬具有高度致死率，可達50%-100%。1945年 Doyle在美國首次報道了運一疾病后，世界上的許多國家相繼報道了該病。1956年在我國廣 東首次發(fā)現(xiàn)該病，近年來疫區(qū)更為擴大，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重危害并造成巨大的經(jīng)濟損失。
[0004] 豬輪狀病毒感染（porcine rotavirus infection)是由呼腸孤病毒科 (reoviridae)的輪狀病毒屬（rotavirus)的輪狀病毒（porcine ;ro1:avi;rus，F(xiàn)*oRV)引起的一 種急性消化道傳染病，W嘔吐、腹瀉、厭食不安為特征，可感染各年齡段的豬，W2-5周齡的 仔豬多發(fā)，仔豬出現(xiàn)脫水和死亡且死亡率達50%-100%。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，豬群中 化RV的帶毒率非常高，中豬和大豬多為亞臨床感染和隱性感染。
[0005] 豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒感染是目前已經(jīng)證實的、引起豬發(fā)生 腹瀉的重要的=種病毒傳染性疾病，運=種疾病主要對仔豬的影響較大，是引起仔豬死亡 的主要病毒性腹瀉病。運=種疾病常?；旌细腥竞屠^發(fā)感染，在流行病學(xué)、臨床癥狀、病理 解剖學(xué)變化上都非常相似，很難區(qū)別到底是哪一種病毒感染，而且發(fā)病急速，在發(fā)病后近幾 個小時，就可波及全群，造成哺乳期仔豬的大批死亡，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大的損失。特別是， 隨著集中化養(yǎng)豬的規(guī)模日益擴大，豬的腹瀉疾病變得日趨嚴(yán)重。因此，亟需一種能同時實現(xiàn) 豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒的檢測方法。
[0006] 目前，檢測運幾種疾病的方法包括病毒分離鑒定和血清檢查，但操作過程繁瑣、耗 時過長;而PCR/RT-PCR檢測雖然靈敏，但需要?？诘膬x器和專業(yè)的操作人員，運些方法均不 適合基層或現(xiàn)場快速檢測。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)雖也有檢測各自抗原的單一膠體金檢測試紙條，但價格昂貴或檢測靈敏 度低。因而，亟需研制一種能簡單、快速、準(zhǔn)確、同時檢測多種疾病的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種檢測試劑盒，該試劑盒可簡單、快 速、靈敏度高并同時檢測出兩種或=種病毒。
[0009] 本發(fā)明設(shè)及一種試劑盒，其中，所述試劑盒包括有效量的抗豬流行性腹瀉病毒單 克隆抗體PEDV-McABl、P抓V-MCAB2，W及用于檢測豬流行性腹瀉病毒抗原抗體反應(yīng)的檢測 試劑;有效量的抗豬傳染性胃腸炎病毒單克隆抗體TGEV-MCAB3、TGEV-McAB4，W及用于檢測 豬傳染性胃腸炎病毒抗原抗體反應(yīng)的檢測試劑;和/或與有效量的抗豬輪狀病毒單克隆抗 體化RV-McAB5、PoRV-McAB6，W及用于檢測豬輪狀病毒抗原抗體反應(yīng)的檢測試劑;其中，所 述單克隆抗體PEDV-McABl重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID No.2,和/或輕鏈可變區(qū)的氨 基酸序列為SEQ ID No.4,所述單克隆抗體PEDV-MCAB2重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID No.6,和/或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID No.8;所述單克隆抗體PEDV-McABl固定在 支持介質(zhì)上，所述單克隆抗體PEDV-MCAB2溶解于反應(yīng)液中；所述抗豬傳染性胃腸炎病毒單 克隆抗體TGEV-MCAB3與TGEV-MCAB4能同時與豬傳染性胃腸炎病毒產(chǎn)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)， 所述單克隆抗體TGEV-MCAB3固定在支持介質(zhì)上，所述單克隆抗體TGEV-MCAB4溶解于反應(yīng)液 中；所述抗豬輪狀病毒單克隆抗體化RV-McABS和化RV-McABS能同時與豬輪狀病毒產(chǎn)生抗原 抗體結(jié)合反應(yīng)，所述單克隆抗體PoRV-McABS固定在支持介質(zhì)上，所述單克隆抗體PoRV-McAB6溶解于反應(yīng)液中。
[0010]本發(fā)明還設(shè)及一種試劑盒，其中，所述試劑盒包括有效量的所述單克隆抗體陽〇￥-McABl、PEDV-McAB2，W及用于檢測豬流行性腹瀉病毒抗原抗體反應(yīng)的檢測試劑;有效量的 抗豬傳染性胃腸炎病毒單克隆抗體TGEV-MCAB3、TGEV-MCAB4，W及用于檢測豬傳染性胃腸 炎病毒抗原抗體反應(yīng)的檢測試劑;和/或與有效量的抗豬輪狀病毒單克隆抗體化RV-McABS、 PoRV-McABe，W及用于檢測豬輪狀病毒抗原抗體反應(yīng)的檢測試劑;其用于檢測抗原抗體反 應(yīng)的檢測試劑為膠體金。
[0011] 本發(fā)明還設(shè)及一種試劑盒，其中，所述試劑盒包括有效量的所述單克隆抗體?60￥-McABl、PEDV-McAB2，W及用于檢測豬流行性腹瀉病毒抗原抗體反應(yīng)的檢測試劑;有效量的 抗豬傳染性胃腸炎病毒單克隆抗體TGEV-MCAB3、TGEV-MCAB4，W及用于檢測豬傳染性胃腸 炎病毒抗原抗體反應(yīng)的檢測試劑;和/或有效量的抗豬輪狀病毒單克隆抗體PoRV-McABS、 PoRV-McABe，W及用于檢測豬輪狀病毒抗原抗體反應(yīng)的檢測試劑;其用于檢測抗原抗體反 應(yīng)的檢測試劑為酶-底物。
[0012] 本發(fā)明還設(shè)及本發(fā)明所述的試劑盒在用于非診斷目的的豬流行性腹瀉病毒抗原、 豬傳染性胃腸炎病毒抗原和/或豬輪狀病毒抗原檢測中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明所提供的試劑盒可用于非診斷目的的豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎 病毒和/或豬輪狀病毒檢測中的應(yīng)用，簡單、快速并且靈敏度高。
【附圖說明】
[0014] 圖1為SDS-PAGE凝膠電泳鑒定單克隆抗體陽DV-McABl和單克隆抗體陽DV-MCAB2的 純度，其中泳道1為蛋白Marker;泳道2為單克隆抗體PEDV-McABl，包括上端的重鏈和下端的 輕鏈，泳道3為單克隆抗體PEDV-MCAB2,包括上端的重鏈和下端的輕鏈。
[0015] 圖2為酶免疫層析檢測試紙條的側(cè)向示意圖，圖中：（1)硝酸纖維素膜，（2)酶標(biāo)墊， (3)底物墊，（4)吸水墊，（5)展開液墊，（6)檢測線，（7)質(zhì)控線，（8)底物緩沖液槽，（9)底物緩 沖液，（10)支撐物，（11)檢測樣品。圖2A為檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒或 豬輪狀病毒時的檢測試紙條的側(cè)向示意圖；圖2B為檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸 炎病毒和豬輪狀病毒時的檢測試紙條的側(cè)向示意圖。
【具體實施方式】
[0016] W下，對本發(fā)明的實施方式進行說明。
[0017] 本發(fā)明的一個方面設(shè)及一種試劑盒，其中，所述試劑盒包括有效量的抗豬流行性 腹瀉病毒單克隆抗體PEDV-McABl、P抓V-MCAB2，W及用于檢測豬流行性腹瀉病毒抗原抗體 反應(yīng)的檢測試劑;有效量的抗豬傳染性胃腸炎病毒單克隆抗體TGEV-MCAB3、TGEV-McAB4，W 及用于檢測豬傳染性胃腸炎病毒抗原抗體反應(yīng)的檢測試劑;和/或與有效量的抗豬輪狀病 毒單克隆抗體化RV-McABS、PoRV-McAB6, W及用于檢測豬輪狀病毒抗原抗體反應(yīng)的檢測試 劑;其中，所述單克隆抗體PEDV-McABl重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID No. 2,和/或輕鏈 可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID No.4,所述單克隆抗體PEDV-MCAB2重鏈可變區(qū)的氨基酸序 列為SEQ ID No.6,和/或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID No.8;所述單克隆抗體PEDV-McABl固定在支持介質(zhì)上，所述單克隆抗體PEDV-MCAB2溶解于反應(yīng)液中；所述抗豬傳染性胃 腸炎病毒單克隆抗體TGEV-MCAB3與TGEV-MCAB4能同時與豬傳染性胃腸炎病毒產(chǎn)生抗原抗 體結(jié)合反應(yīng)，所述單克隆抗體TGEV-MCAB3固定在支持介質(zhì)上，所述單克隆抗體TGEV-MCAB4 溶解于反應(yīng)液中；所述抗豬輪狀病毒單克隆抗體化RV-McABS和化RV-McABS能同時與豬輪狀 病毒產(chǎn)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，所述單克隆抗體PoRV-McABS固定在支持介質(zhì)上，所述單克隆 抗體化RV-McABS溶解于反應(yīng)液中。
[0018] 術(shù)語"單克隆抗體"是指獲自基本上同源的抗體群的抗體，即組成該群體的抗體個 體都相同，除了可能存在少量可能的自發(fā)突變。因此，修飾語"單克隆"是指該抗體的性質(zhì)不 是離散抗體的混合物。優(yōu)選地，所述單克隆抗體包括單價的或是單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合 抗體、豬源化抗體W及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗 原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多膚?？贵w為涵蓋具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意特異性結(jié)合因 子，因而，運個術(shù)語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、豬源化抗體W及抗體的功能等同 物和同源物，也包括含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多膚，無論是天然的還是合成產(chǎn)生的?？贵w 的實例是免疫球蛋白亞型（如IgG, I姐，IgM, I曲和IgA)及其亞型亞類;也可W是包含抗原結(jié) 合結(jié)構(gòu)域的片段如化13、3。。￥^￥、(1413少(1;和雙鏈抗體((11曰130(1163)。融合至另一多膚的、包 含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克隆與表達在 EP. A. 0120694和EP. A. 0125023中描述。抗體可W通過許多方式修飾，可用DNA重組技術(shù)來產(chǎn) 生保留原來抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。運種技術(shù)可W包括將編碼抗體的免疫球蛋 白可變區(qū)或互補性決定區(qū)（CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)， 參見EP.A. 184187 ,GB2188638A或EP.A. 239400。還可W對雜交瘤細(xì)胞或產(chǎn)生抗體的其它細(xì) 胞進行遺傳突變或其它改變，運可W改變或者不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。用于本發(fā) 明的"單克隆抗體"也可用雜交瘤方法制得，因為編碼本發(fā)明鼠源化抗體的DNA序列可用本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段，如根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列人工合成或用PCR法擴增 得到，因而也可用重組DNA方法，可用本領(lǐng)域熟知的各種方法將該序列連入合適的表達載體 中。最后，在適合本發(fā)明抗體表達的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細(xì)胞，然后本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)用熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的單克隆抗體。抗體包含通過二硫橋連接 在一起的多膚鏈幾何體，稱為輕鏈和重鏈的兩條多膚主鏈構(gòu)成抗體的所有主要結(jié)構(gòu)類別 (同型物）。重鏈和輕鏈都進一步可分為稱作可變區(qū)和恒定區(qū)的一些亞區(qū)。重鏈包括單個的 可變區(qū)和=個不同的恒定區(qū)，輕鏈則包括單個可變區(qū)（不同于重鏈的可變區(qū)）和單個恒定區(qū) (不同于重鏈的恒定區(qū)）。重鏈和輕鏈的可變區(qū)負(fù)責(zé)抗體的結(jié)合特異性。
[0019] 術(shù)語"重鏈可變區(qū)"是指一種多膚，其長度為110至125個氨基酸，其氨基酸順序相 應(yīng)于本發(fā)明單克隆抗體從重鏈N末端氨基酸開始的重鏈氨基酸順序。同樣，術(shù)語"輕鏈可變 區(qū)"是指一種多膚，其長度為95至115個氨基酸，其氨基酸順序相應(yīng)于本發(fā)明單克隆抗體從 輕鏈N末端氨基酸開始的輕鏈氨基酸順序。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯然知曉，在本發(fā)明所具體 公開的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列基礎(chǔ)上，可W通過常規(guī)基因工程 和蛋白質(zhì)工程方法進行一個或多個氨基酸的添加、刪除、替換等