語"檢測樣品"包括但不限于動物或患者的排泄物、口鼻腔分泌物、動物細(xì)胞培 養(yǎng)的完整病毒或裂解病毒液等。
[0033] 本發(fā)明還設(shè)及所述試劑盒檢測樣品中病毒的方法，所述方法包括：（1)將檢測樣品 與所述單克隆抗體陽0￥-]?。481、？抓￥-]\^482，所述單克隆抗體166￥-]\1。483和166￥-]\^484， 和/或所述單克隆抗體PoRV-McABS、PoRV-McAB6進(jìn)行接觸，（2)檢測所述單克隆抗體PEDV-McABl、P抓V-McAB2，所述單克隆抗體TGEV-McAB3和TGEV-McAB4，和/或所述單克隆抗體 化RV-McABS、PoRV-McAB6與樣品中病毒的反應(yīng);其中，所述方法步驟（1)中的所述單克隆抗 體陽DV-McABl、所述單克隆抗體TGEV-MCAB3和/或所述單克隆抗體PoRV-McABS附著在支持 介質(zhì)上，所述支持介質(zhì)優(yōu)選為微滴定板、磁顆粒、乳膠顆粒、硝酸纖維素膜中的任一種；其 中，所述方法步驟(2)中所述反應(yīng)可通過酶顯色、膠體金、巧光、化學(xué)發(fā)光中的任一種方法進(jìn) 行測定。
[0034] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述方法包括:將采集的微生物拭子插入到樣品處 理管中，使樣品盡可能溶解在溶液中，將處理后的樣品滴加至檢測試紙條加樣孔中屯、，10分 鐘或30分鐘后判定結(jié)果：（1)若質(zhì)控線處并無條帶，無論檢測線處是否有條帶，檢測過程均 無效，（2)在質(zhì)控線處有條帶的情況下，若檢測線處有條帶則為陽性，否則為陰性，即：質(zhì)控 線的有無決定了檢測過程是否有效，若質(zhì)控線處并無條帶，無論檢測線處是否有條帶，檢測 過程均無效，在質(zhì)控線處有條帶的情況下，若檢測線處有條帶則為陽性，否則為陰性。
[0035] 本發(fā)明的一個(gè)方面設(shè)及所述試劑盒在用于非診斷目的的豬流行性腹瀉病毒、豬胃 腸炎病毒和/或豬輪狀病毒檢測中的應(yīng)用。
[0036] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明提供了包括有效量的所述單克隆抗體PEDV-McABU陽DV-McAB2和有效量的所述單克隆抗體TGEV-McAB3、TGEV-McAB4的試劑盒在用于非 診斷目的的豬流行性腹瀉病毒、豬胃腸炎病毒檢測中的應(yīng)用。
[0037] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明提供了包括有效量的所述單克隆抗體PEDV-McABU陽DV-McAB2和有效量的所述單克隆抗體化RV-McAB5、PoRV-McAB6的試劑盒在用于非 診斷目的的豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒檢測中的應(yīng)用。
[0038] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明提供了包括有效量的所述單克隆抗體PEDV-McABU陽DV-McAB2,有效量的所述單克隆抗體TGEV-McAB3、TGEV-McAB4和有效量的所述單 克隆抗體P〇RV-McAB5、PoRV-McAB6的試劑盒在用于非診斷目的的豬流行性腹瀉病毒、豬胃 腸炎病毒、豬輪狀病毒檢測中的應(yīng)用。
[0039] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述非診斷目的的檢測包括流行病學(xué)分析、對離體 組織進(jìn)行檢測、表位鑒定研究W及定性和定量鑒別檢驗(yàn)含豬流行性腹瀉病毒抗原、豬傳染 性胃腸炎病毒抗原和/或豬輪狀病毒抗原和其他抗原的疫苗組合物中的豬流行性腹瀉病毒 抗原、豬傳染性胃腸炎病毒抗原和/或豬輪狀病毒抗原的檢測。
[0040] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的 優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述更為清楚。但運(yùn)些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu) 成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可W對本發(fā) 明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但運(yùn)些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍 內(nèi)。本發(fā)明所述的實(shí)驗(yàn)方法，若無特殊說明，均為常規(guī)方法;所述的生物材料，若無特殊說 明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0041 ] 實(shí)施例1抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體陽DV-McABl、P抓V-MCAB2的制備、純化、 鑒定及檢驗(yàn)
[0042] 1.1抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體的制備和純化
[0043] 將豬流性腹瀉病毒HN1301株按照張麗燕等(張麗燕.豬流行性腹瀉病毒單克隆抗 體的研制.四川農(nóng)業(yè)大學(xué).碩±論文）中的方法純化病毒，免疫小鼠，克隆獲得雜交瘤細(xì)胞2 株，分別制備2株單克隆抗體。
[0044] 將制備的2株單克隆抗體按照陳丹等（陳丹，孫廣瑞，柳增善.辛酸-硫酸錠聯(lián)合沉 淀法在單克隆抗體純化中的應(yīng)用.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(26): 8105，8108)的辛酸-硫酸錠 聯(lián)合沉淀法純化單克隆抗體的操作方法分別純化抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體PEDV-McABU 陽DV-McAB2。
[0045] 1.2抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體的鑒定
[0046] 1.2.1單克隆抗體類型和亞類的鑒定
[0047] 運(yùn)用Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit并參照說明書對抗體的亞 型進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果見表1:
[004引表1各單克隆抗體類型的鑒定
[0050] 注:+表示陽性反應(yīng)，-表示陰性反應(yīng)。
[0化1] 由表1可知，單克隆抗體陽DV-McABU陽DV-MCAB2重鏈亞型都為IgG2a，輕鏈類型都 為k曰卵曰。
[0052] 1.2.2單克隆抗體特異性的鑒定
[0053] 將？60￥^66￥、？〇3￥、？1?1?5￥、？1?￥及￥6'〇細(xì)胞分別包被反應(yīng)板，測定單克隆抗體 陽D V-McABl、單克隆抗體陽D V-McAB2與陽DV、TGEV、I^RV、PRRSV、PRV及Vero細(xì)胞是否具有交 叉反應(yīng)性。
[0054] 測定結(jié)果顯示：單克隆抗體 PEDV-McABl、P抓 V-McAB2 與 Vero細(xì)胞均無交叉反應(yīng)，僅與陽DV反應(yīng)呈陽性，表明單克隆抗體陽DV-McABl、陽DV-MCAB2均 是抗豬流行性腹瀉病毒的特異性單克隆抗體。
[0055] 1.3純化后單克隆抗體的檢驗(yàn)
[0056] 1.3.1外觀檢驗(yàn)
[0化7] 室溫下，肉眼觀察可見純化的單克隆抗體PEDV-McABl、P抓V-McAB2均呈無色澄清 狀態(tài)，未見絮狀物沉淀。
[0化引 1.3.2無菌檢驗(yàn)
[0059] 采用無菌檢驗(yàn)法，分別取純化后的單克隆抗體原料接種IOml/管的營養(yǎng)瓊脂斜面 培養(yǎng)基、改良馬下培養(yǎng)基和硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基各2管(接種量為0.5ml/管）。接種后的硫乙醇 酸鹽培養(yǎng)基及營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基各一管置于30-35°C培養(yǎng)，另一管于20-25°C培養(yǎng)。改良 馬下培養(yǎng)基置于20-25°C培養(yǎng)。同時(shí)W無菌生理鹽水同法操作做陰性對照。培養(yǎng)14天后均未 觀察到培養(yǎng)基中有微生物生長，觀察結(jié)果表明：單克隆抗體陽DV-McABU陽DV-MCAB2原料均 符合無菌要求。
[0060] 1.3.3單克隆抗體的純度
[0061 ] 采用SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行鑒定，上樣量為lOiig，檢測結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明： 單克隆抗體陽DV-McABl、陽DV-McAB2的純度均不低于95%。
[0062] 1.3.4單克隆抗體相對親和力的測定
[0063] 將制備的單克隆抗體PED V-McAB 1、陽DV-Mc AB2按照宋帥等(宋帥，林形，邵軍軍，常 惠蕓.抗0型口蹄疫病毒單克隆抗體相對親和力的測定.獸醫(yī)免疫學(xué)，2009，25(4): 333-335) 中的操作方法測定其相對親和力。其中抗原的包被濃度為扣g/ml，酶標(biāo)二抗的稀釋度為1: 10000,測定純化后的單克隆抗體的相對親和力。計(jì)算結(jié)果表明：單克隆抗體PEDV-McABl的 相對親和力為0.7祉g/ml，單克隆抗體PEDV-MCAB2的相對親和力為0.4化g/ml。
[0064] 1.3.5單克隆抗體中和活性的測定
[0065] 2株單克隆抗體與500TCI化0的不同來源的PEDV毒株中和后接種Vero細(xì)胞，通過中 和試驗(yàn)測定該單克隆抗體具有中和疫苗株P(guān)EDV CV777株、疫苗株SM98株及流行毒株的代表 毒株HNl 301株的能力。測得單克隆抗體PEDV-McABl中和抗體效價(jià)均不小于1:512，表明單克 隆抗體PEDV-McABl具有良好的中和活性，而單克隆抗體PEDV-MCAB2的中和抗體效價(jià)均小于 1:2，表明單克隆抗體陽DV-MCAB2無中和活性。
[0066] 表2用不同毒株與本發(fā)明陽D V-Mc AB1、P抓V-Mc AB 2單克隆抗體中和后測得的中和 抗體效價(jià)
[0068] 1.4單克隆抗體含量的測定
[0069] 用BCA蛋白定量試劑盒分別對單克隆抗體陽DV-McABl、P抓V-MCAB2按照說明書進(jìn) 行定量分析，測定結(jié)果表明：單克隆抗體陽DV-McABl、P抓V-McAB2的濃度分別為4、4.5mg/ ml O
[0070] 1.5單克隆抗體的配對
[0071] 選擇HN1301株豬流行性腹瀉病毒，稀釋到105'DTCID5G/ml，對不同搭配模式進(jìn)行檢 ，結(jié)果見表3:
[0072] 表3單克隆抗體搭配
[0074] 注：V'表示陽性，表示陰性。
[0075] 結(jié)果表明：標(biāo)記單克隆抗體陽DV-McABl和固定單克隆抗體陽DV-MCAB2檢測豬流行 性腹瀉病毒液為陰性，其余搭配檢測結(jié)果均為陽性。因而選擇固定單克隆抗體PEDV-McABl、 標(biāo)記單克隆抗體PEDV-MCAB2為搭配方式。
[0076] 1.6單克隆抗體可變區(qū)序列的測定
[0077] 1.6.1單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)引物設(shè)計(jì)
[0078] 根據(jù)鼠源單克隆抗體的序列特征，設(shè)計(jì)重鏈可變區(qū)引物序列：
[0081] 設(shè)計(jì)輕鏈可變區(qū)引物序列：
[0084] 1.6.2單克隆抗體可變區(qū)序列測定
[0085] 按照張愛華等(張愛華，閉蘭，王志友等.系列鼠抗CD分子單克隆抗體輕、重鏈可變 區(qū)基因的克隆和序列分析.中國生物制品學(xué)雜志，2001，15(2):65-68)建立的可變區(qū)序列測 定方法，通過分子克隆技術(shù)分別獲得單克隆抗體PEDV-McABl、PEDV-McAB2的可變區(qū)序列，選 取對應(yīng)的克隆質(zhì)粒送至蘇州金維智生物科技有限公司進(jìn)行測序。
[0086] 測定單克隆抗體陽DV-McABl的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)的基因序列分別如SEQ ID No. USEQ ID No.3所示，由其推導(dǎo)的氨基酸序列分別為SEQ ID No.2、SEQ ID No.4;單克隆 抗體PEDV-McAB2的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)的基因序列分別如SEQ ID No.5、SEQ ID No.7 所示，由其推導(dǎo)的氨基酸序列分別為SEQ ID No.6、SEQ ID No.8。
[0087] 實(shí)施例2試劑盒的制備及應(yīng)用
[0088] 2.1試劑盒之膠體金檢測試紙條
[0089] 2.1.1試劑盒之膠體金檢測試紙條的制備及應(yīng)用
[0090] 試劑盒包括膠體金檢測試紙條、樣品處理液（即含2%CHAPS的抑7.4的憐酸鹽緩沖 液）、樣品處理管、樣品保存液，樣品保存液（即pH7.4的憐酸鹽緩沖液)在樣品保存瓶中，其 中膠體金檢測試紙條的制備如下：
[0091] 按照中國CN101614737A建立的膠體金制備方法制備膠體金溶液，并分別標(biāo)記單克 隆抗體PEDV-McAB2(實(shí)施例1制備的抗豬流行性腹瀉病毒單克隆抗體PEDV-MCAB2，用pH7.4 憐酸鹽緩沖液稀釋至標(biāo)記濃度為25化g/ml)、單克隆抗體TGEV-McAB4(抗豬傳染性胃腸炎病 毒單克隆抗體JY(4)-3,標(biāo)記濃度為20化g/ml)、單克隆抗體化RV-McAB6(抗豬輪狀病毒單克 隆抗體A6，標(biāo)記濃度為50化g/ml)，單克隆抗體PEDV-McABl (實(shí)施例1制備的抗豬流行性腹瀉 病毒單克隆抗體PEDV-McABl，固定包被濃度為20化g/ml)、單克隆抗體TGEV-MCAB3(抗豬傳 染性胃腸炎病毒單克隆抗體4E2，用pH7.4的憐酸鹽緩沖液稀釋至固定濃度為15化g/ml)和/ 單克隆抗體化RV-McAB5(抗豬