基于重組酶的邏輯與存儲系統的制作方法
【專利說明】基于重組酶的還輯與存儲系統
[OOCM] 相關申請
[0002] 本申請按照35U.S.C. § 119(e)要求2012年12月13日提交的美國臨時申請?zhí)?61/736, 792和2013年1月26日提交的美國臨時申請?zhí)?1/757, 113的權益，其各自通過引 用整體并入本文中。
[0003] 聯邦政府資助研究
[0004] 本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究院授予的基金No. 0D008435W及空間和海上作戰(zhàn) 系統中屯、（Spaceand化valWarfareSystemsCenter)提供的合同No.N66001-12-C-4016 的政府資助下完成的。政府對發(fā)明享有一定權利。
【背景技術】
[0005] 合成生物學的一個重要目標是創(chuàng)建整合輸入信號W作出決策和采取行動的細胞 網絡[1]。近年來，已經獨立構建了人工邏輯口 [2-4]和存儲設備[5,6]。在之前實現細胞 邏輯的過程中，復雜的口需要多個基因電路的分層巧，7]，因此，需要為電路構建體和調整 做出重大努力。運些復雜的邏輯口僅能實現組合邏輯。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明特別提供了用于在活細胞中集成組合邏輯與存儲的合成的基于重組酶的 系統。集成邏輯與存儲對于執(zhí)行復雜而持久的狀態(tài)依賴性計算（如時序邏輯）是至關重要 的巧]。使用所限定的一組編程規(guī)則，本發(fā)明的邏輯與存儲系統能夠高效地、一步到位組建 任何布爾邏輯函數，對事件進行穩(wěn)定的、基于DNA的存儲。運些系統利用化學誘導物輸入 來驅動正交重組酶（〇：rthogonalrecombinase)從啟動子表達。運些重組酶祀向DNA反向 (inversion)或切除的遺傳元件，從而導致有條件的核酸表達。運種邏輯與存儲系統對于多 種應用（包括編程細胞狀態(tài)機、用于治療診斷的行為和途徑W及基礎科學應用）是有用的。
[0007] 因此，在本發(fā)明的一些方面，本文中提供了可在單個細胞中運行的合成邏輯與存 儲系統，該系統包括多個核酸序列，所述多個核酸序列編碼至少兩個啟動子和至少兩種重 組酶，其中多個編碼重組酶的核酸序列中的每一個與不同的啟動子有效連接；多個邏輯口， 所述多個邏輯口是與基因調控元件（例如啟動子和/或單向終止子）有效連接或者有條件 地有效連接的輸出核酸序列的單基因電路構建體（singlegeneticcircuitconstruct), 其中輸出核酸和基因調控元件（例如啟動子及單向終止子）中的至少一個的側翼有至少 一種重組酶的正向識別位點和反向識別位點，并且其中除了TR肥邏輯口和FALSE邏輯口之 夕F，邏輯口提供所有的二輸入布爾邏輯函數。
[0008] 在本發(fā)明的一些方面，本文中提供了可在單個細胞中運行的合成邏輯與存儲系 統，該系統包括多個核酸序列，所述多個核酸序列編碼至少兩個啟動子和至少兩種重組酶， 其中多個編碼重組酶的核酸序列中的每個核酸序列與不同的啟動子有效連接；多個邏輯 n，所述多個邏輯口是與基因調控元件（例如啟動子和/或單向終止子）有效連接或者有 條件地有效連接的輸出核酸序列的單基因電路構建體，其中輸出核酸和基因調控元件例如 啟動子及單向終止子中的至少一個的側翼有至少一種重組酶的正向識別位點和反向識別 位點，并且其中邏輯口提供至少兩個二輸入布爾邏輯函數。在一些實施方案中，邏輯口提供 至少=個二輸入布爾邏輯函數、至少四個二輸入布爾邏輯函數、至少五個二輸入布爾邏輯 函數、至少六個二輸入布爾邏輯函數、至少屯個二輸入布爾邏輯函數、至少八個二輸入布爾 邏輯函數或至少九個二輸入布爾邏輯函數。在一些實施方案中，邏輯口提供TR肥邏輯口和 FALSE邏輯口，而在另一些實施方案中，邏輯口不提供TR肥邏輯口和FALSE邏輯口。
[0009] 重組酶的表達與目的信號有效連接，例如外部輸入信號或細胞調控信號。在一些 實施方案中，至少兩個啟動子中的一個或更多個啟動子是誘導型啟動子。
[0010] 在一些實施方案中，至少兩種重組酶是不可逆重組酶。在一些實施方案中，至少兩 種不可逆重組酶是絲氨酸重組酶。在一些實施方案中，絲氨酸重組酶是Bxbl和地iC31。
[0011] 在一些實施方案中，邏輯口為NOR、AND、OR、NAND、A、NOTA、B、NOTB、AIMPLYB、 ANIMPLYB、BIMPLYA、BNIMPLYA、XOR及XNOR。在一些實施方案中，本發(fā)明的合成邏輯與 存儲系統還包括TR肥邏輯口和/或FALSE邏輯口，其中TR肥邏輯口是與啟動子有效連接 的輸出核酸序列的單基因電路構建體，W及其中FALSE邏輯口是緊接反向啟動子下游的輸 出核酸序列的單基因電路構建體。
[0012] 在一些實施方案中，輸出核酸編碼輸出產物。在一些實施方案中，輸出產物是報道 蛋白（reporterprotein)、轉錄阻遏物、轉錄激活因子、選擇標志物、酶、受體蛋白、配體蛋 白、RNA、核糖開關、短發(fā)夾RNA或重組酶。
[0013]在一些實施方案中，NOR邏輯口是（a)與啟動子有效連接的輸出核酸和化）兩個 單向終止子的單基因電路構建體，其中每個終止子是反向的并且側翼有不同的正向和反向 重組酶識別位點并且每個終止子位于啟動子與輸出核酸之間。
[0014] 在一些實施方案中，AND邏輯口是與啟動子有條件地有效連接的輸出核酸的單基 因電路構建體，其中輸出核酸和啟動子各自是反向的并且側翼有不同的正向和反向重組酶 識別位點。
[0015] 在一些實施方案中，OR邏輯口是與兩個啟動子有條件地有效連接的輸出核酸的 單基因電路構建體，其中每個啟動子是反向的并且側翼有不同的正向和反向重組酶識別位 點。
[0016] 在一些實施方案中，NAND邏輯口是與兩個啟動子有效連接的輸出核酸的單基因電 路構建體，其中每個啟動子的側翼有不同的正向和反向重組酶識別位點。
[0017] 在一些實施方案中，A邏輯口是與啟動子有條件地有效連接的輸出核酸的單基因 電路構建體，其中輸出核酸是反向的并且側翼有正向和反向重組酶識別位點。
[0018] 在一些實施方案中，B邏輯口是與啟動子有條件地有效連接的輸出核酸的單基因 電路構建體，其中啟動子是反向的并且側翼有正向和反向重組酶識別位點。
[0019] 在一些實施方案中，NOTA邏輯口是與啟動子有效連接的輸出核酸的單基因電路 構建體，其中輸出核酸的側翼有正向和反向重組酶識別位點。
[0020] 在一些實施方案中，NOTB邏輯口是與啟動子有效連接的輸出核酸的單基因電路 構建體，其中啟動子的側翼有正向和反向重組酶識別位點。
[0021] 在一些實施方案中，AIMPLYB邏輯口是與第一啟動子有效連接并且與第二啟動 子有條件地有效連接的輸出核酸的單基因電路構建體，其中第一啟動子的側翼有正向和反 向重組酶識別位點，而且第二啟動子是反向的并且側翼有不同的正向和反向重組酶識別位 點并且位于第一啟動子與輸出核酸之間。
[0022] 在一些實施方案中，BIMPLYA邏輯口是與第一啟動子有條件地有效連接并且與 第二啟動子有效連接的輸出核酸的單基因電路構建體，其中第一啟動子是反向的并且側翼 有正向和反向重組酶識別位點，而且第二啟動子的側翼有不同的正向和反向重組酶識別位 點并且位于第一啟動子與輸出核酸之間。
[0023] 在一些實施方案中，ANIMPLYB邏輯口是與啟動子有條件地有效連接的輸出核酸 的單基因電路構建體，其中啟動子的側翼有正向和反向重組酶識別位點，而且輸出核酸是 反向的并且側翼有不同的正向和反向重組酶識別位點。
[0024] 在一些實施方案中，BNIMPLYA邏輯口是與啟動子和單向終止子有條件地有效連 接的輸出核酸的單基因電路構建體，其中啟動子是反向的并且側翼有正向和反向重組酶識 別位點，而且終止子是反向的并且側翼有不同的正向和反向重組酶識別位點并且位于啟動 子與輸出核酸之間。
[00巧]在一些實施方案中，XOR邏輯口是與啟動子有條件地有效連接的輸出核酸的單基 因電路構建體，其中啟動子是反向的并且側翼有兩個不同的正向和反向重組酶識別位點。
[0026] 在一些實施方案中，XNOR邏輯口是與啟動子有效連接的輸出核酸的單基因電路構 建體，其中輸出核酸的側翼有兩個不同的正向和反向重組酶識別位點。
[0027] 在一些實施方案中，邏輯口可W包含含有至少兩個啟動子（例如，組成型啟動子） 的單基因電路構建體，任選地，其中每個啟動子具有不同的強度。在一些實施方案中，邏輯 口可W包含一對啟動子，任選地，其中每個啟動子具有不同的強度。運樣的一對啟動子（如 果具有不同的強度）在本文中可W指的是一對變體啟動子。在一些實施方案中，啟動子選 自proD、proA及proC。
[0028] 在另一些方面，本文提供了包含本發(fā)明的合成邏輯與存儲系統的細胞。在一些實 施方案中，該細胞包含本發(fā)明的至少兩個邏輯口。
[0029] 在又一些方面，本文提供了改變基因表達或細胞分化的方法，該方法包括改造細 胞W使其包含本發(fā)明的至少兩個邏輯口和至少一種重組酶。
【附圖說明】
[0030] 附圖并不意在按比例繪制。在附圖中，在多個圖中所示的每個相同或近似相同的 部件用相似附圖標記（numeral)表示。出于清楚的目的，沒有將每幅附圖中的每個部件都 進行標記。
[0031]圖1示出了用于建立根據本發(fā)明的基于重組酶的集成邏輯與存儲系統的平臺的 原理圖，該平臺包含將所需的計算函數轉換成[啟動子]-[終止子]-[輸出]設計的簡單 編程語言，運可用簡單易懂的Gibson組裝構建。N-酷基高絲氨酸內醋（AHL)("輸入A") 通過正交核糖調控系統（〇：rthogonalriboregulatedsystem)激活Bxbl重組酶的表達，而 無水四環(huán)素（anhy化Otetra巧cline，aTc)("輸入B")通過正交核糖調控系統激活地iC31 重組酶的表達。運里所示出的實例口實現了AND功能性。該邏輯口的性能由在暴露于指定 組的輸入之后采用流式細胞術所測定的綠色巧光蛋白（GF巧陽性的細胞百分比來表征。通 過=次獨立的實驗進行測量，并且誤差條表示均值的標準誤差。
[0032] 圖2示出了本發(fā)明的邏輯口的原理圖，運在不將多個通用口級聯在一起的情況下 實現了完整的一組布爾邏輯口。細胞暴露于沒有輸入，僅AHU僅aTc，或者同時AHL和aTc。 每個邏輯口的性能由采用流式細胞術所測定的GFP陽性的細胞百分比來表征。通過=次獨 立的實驗進行測量，并且誤差條表示均值的標準誤差。
[0033] 圖3示出了根據本發(fā)明的簡單編程規(guī)則的原理圖，其支配基于重組酶的基因電路 的行為，使邏輯口的多種示例具有各個遺傳元件的不同組合。除了圖1和圖2的設計之外， 描述了（a)NOR、化)AND和（C)XOR邏輯口的獨特實現方式。通過S次獨立的實驗進行測量， 并且誤差條表示均值的標準誤差。
[0034] 圖4A示出了證明經過多個細胞世代存儲保持的數據的圖。包含AND口的細胞在 第0天之后被誘導至ON狀態(tài)（GFP表達呈陽性/GFP陽性）并且此后9天在沒有輸入信號 的情況下被不斷稀釋和培養(yǎng)。維持GFP表達的細胞百分比采用流式細胞術進行測定。通過 =次獨立的實驗進行測量，并且誤差條表示均值的標準誤差。
[0035] 圖4B示出了聚合酶鏈式反應（PCR)產物的電泳凝膠圖像（右）并且附上了邏輯 口原理圖（左）。在細胞死亡之后由PCR(由小箭頭指示引物）檢測NOR口的狀態(tài)。通過在 1 %瓊脂糖凝膠上進行電泳來分析PCR產物。
[0036] 圖5示出了流式細胞術數據的圖表。流式細胞術用于測定基于重組酶的邏輯與存 儲系統的輸出。巧光闊值統一應用于所有系統W確定被視為GFP陽性（ON狀態(tài)）或GFP陰 性（OFF狀態(tài)）的細胞百分比。示出了在沒有任何輸入、僅AHL輸入，僅aTc輸入W及同時 施加AHL和aTc的情況下針對AND口的代表性流式細胞術數據。
[0037] 圖6示出了本發(fā)明的AND邏輯口的質粒圖譜。
[003引圖7示出了本發(fā)明的NOR邏輯口的質粒圖譜。
[0039] 圖8示出了本發(fā)明的AND邏輯口的質粒圖譜。
[0040] 圖9示出了本發(fā)明的OR邏輯口的質粒圖譜。
[0041] 圖10示出了本發(fā)明的NAND邏輯口的質粒圖譜。
[004引圖11示出了本發(fā)明的FALSH邏輯口的質粒圖譜。
[0043] 圖12示出了本發(fā)明的TRUE邏輯口的質粒圖譜。
[0044] 圖13示出了本發(fā)明的A邏輯口的質粒圖譜。
[0045] 圖14示出了本發(fā)明的B邏輯口的質粒圖譜。
[0046] 圖15示出了本發(fā)明的NOTA邏輯口的質粒圖譜。
[0047] 圖16示出了本發(fā)明的NOTB邏輯口的質粒圖譜。
[004引圖17示出了本發(fā)明的AIMPLYB邏輯口的質粒圖譜。
[0049] 圖18示出了本發(fā)明的BIMPLYA邏輯口的質粒圖譜。
[0050] 圖19示出了本發(fā)明的ANIMPLYB邏輯口的質粒圖譜。
[005。圖20示出了本發(fā)明的BNIMPLYA邏輯口的質粒圖譜。
[0052] 圖21示出了本發(fā)明的XOR邏輯口的質粒圖譜。
[0053] 圖22示出了本發(fā)明的XNOR邏輯口的質粒圖譜。
[0054] 圖23示出了本發(fā)明的NORV.2 (版本2)邏輯口的質粒圖譜。
[0055] 圖24示出了本發(fā)明的ANDV.2邏輯口的質粒圖譜。
[0056] 圖25示出了本發(fā)明的XORV.2邏輯口的質粒圖譜。
[0057] 圖26A示出了包含反向的啟動子C(proC)和啟動子A(proA)的用于實現數字模擬 轉換器之邏輯口的原理圖（左）并且附上了GFP表達輸出的圖（右）。細胞暴露于沒有輸 入，僅AHU僅曰1'(3,或者同時AHL和aTc。每個條的右側W巧光的任意單位（a.U.)給出了非 歸一化均值表達水平，并且在輸出（OUT)之下列出了歸一化表達水平，其中它們被四舍五 入到最接近的整數而且IX相當于約2700a.U.。
[0058] 圖26B示出了包含反向的啟動子D(ProD)和啟動子A(ProA)的用于實現數字模擬 轉換器之邏輯口的原理圖（左）并且附上了GFP表達輸出的圖（右）。細胞暴露于沒有輸 入，僅AHU僅曰1'(3,或者同時AHL和aTc。每個條的右側W巧光的任意單位（a.U.)給出了非 歸一化均值表達水平，并且在輸出之下列出了歸一化表達水平，其中它們被四舍五入到最 接近的整數而且IX相當于約2700a.U.。圖26C示出了包含反向的啟動子D(ProD)和啟動 子C(proC)的用于實現數字模擬轉換器之邏輯口的原理圖（左）并附上了GFP表達輸出的 圖（右）。細胞暴露于沒有輸入，僅4田^，僅曰1'(3,或者同時AHL和aTc。每個條的右側W巧 光的任意單位（a.U.)給出了非歸一化均值表達水平，并且在輸出之下列出了歸一化表達 水平，其中它們被四舍五入到最接近的整數而且1X相當于約2700a.U.。
[0059] 圖27示出了數字模擬轉換器之對照構建體的GFP巧光的圖。包含具有反向的啟 動子（proD)之奸P的大腸桿菌細胞和不包含奸P的大腸桿菌細胞表現出了與兩種輸入均 不存在（當AHL和aTc輸入均為'0')的情況下在圖26A至26C中的OX輸出可比的模擬 輸出基因表達水平。
[0060] 圖28示出了通過正向散射和反向散射來測試變體啟動子和重組酶識別位點對 奸P表達的影響由設口之后的流式細胞術表征的GFP巧光的圖。巧光值的測量值基于來自 =次獨立實驗的幾何平均值，并且誤差條表示均值的標準誤差。
[0061] 圖29示出了本發(fā)明的邏輯口的質粒圖譜。
[0062] 圖30示出了本發(fā)明的邏輯口的質粒圖譜。
[0063] 圖31示出了本發(fā)明的邏輯口的質粒圖譜。
[0064] 圖32示出了用于表征相對于重組酶識別位點（RR巧的重組酶正交性 (orthogonality)的方案的一個實例。
[0065] 圖33示出了用于測試重組酶的切除效率和正交性的方案的一個實例。
[0066]圖34示出了針對生物學狀態(tài)機的自動化設計算法的概述的一個實例。
[0067] 圖35示出了啟動下游合成分化網絡的基因方案（geneticscheme)的一個實例。 [006引圖36示出了通過輸入化P)的不同組合和順序產生四種不同的巧光蛋白腫）的 2至4多路復用電路（multiplexercircuit)的一個實例。
[0069] 圖37示出了模擬造血干細胞化SC)分化路徑的網絡。
[0070] 圖38A示出了本發(fā)明的"四色系統"的一個實例，其包含具有包含兩個核酸輸出 (藍色巧光蛋白度F巧和黃色巧光蛋白（YFP))之邏輯口的基因構建體W及具有包含兩個核 酸輸出（紅色巧光蛋白（RF巧和綠色巧光蛋白（GFP))之邏輯口的另一個基因構建體，由此 使兩個細胞輸入映射成四個細胞輸出（一般可擴展成n個輸入一 2"個輸出）。
[0071] 圖38B示出了包含在異丙基0-D-I-硫代半乳糖巧（IPTG)誘導型化(Iac-Ol)啟 動子控制下的Bxbl重組酶和在阿拉伯糖誘導型地AD啟動子控制下的地iC31重組酶的質 粒圖譜。
[0072] 圖38C示出了在暴露于僅阿拉伯糖之后W及在暴露于阿拉伯糖繼而暴露于IPTG 之后在四色系統中遺傳元件的方向，運導致BFP表達之后YFP表達。
[0073] 圖38D示出了在暴露于僅IPTG之后W及在暴露于IPTG繼而暴露于阿拉伯糖之后 在四色系統中遺傳元件的方向，運導致RFP表達之后GFP表達。
[0074] 圖38E分別示出了在暴露于僅IPTG、IPTG然后阿拉伯糖、僅阿拉伯糖或者阿拉伯 糖然后IPTG之后表達RFP、GFP、BFP或YFP的酵母細胞的顯微圖像；該細胞利用四色系統 的構建體轉染。
[00巧]圖39A示出了包含核糖調控的Bxbl重組酶和地iC31重組酶的質粒圖譜。
[0076] 圖39B示出了在暴露于僅aTc之后W及在暴露于aTc繼而暴露于AHL之后在四色 系統中遺傳元件的方向。
[0077] 圖39C示出了在暴露于僅AHL之后W及在暴露于AHL繼而暴露于aTc之后在四色 系統中遺傳元件的方向。
[007引圖40A示出了繪制出在暴露于50ng/mlaTC之后表達BFP的細胞百分比隨時間的 圖。
[0079] 圖40B示出了繪制出在暴露于20化g/mlaTC之后表達BFP的細胞百分比隨時間 的圖。
[0080] 圖40C示出了繪制出在暴露于250ng/mlaTC之后表達BFP的細胞百分比隨時間 的圖。
[0081] 圖40D示出了繪制出在暴露于各種濃度的aTC之后表達BFP的細胞百分比隨時間 的圖。
[008引圖41A示出了繪制出在暴露于aTC繼而暴露于100yMAHL之后表達YFP的細胞 百分比隨時間的圖。
[0083] 圖41B示出了繪制出在暴露于aTC繼而暴露于50yMAHL之后表達YFP的細胞百 分比隨時間的圖。
[0084] 圖41C示出了繪制出在暴露于aTC繼而暴露于IOiiMAHL之后表達YFP的細胞百 分比隨時間的圖。
[00財圖41D示出了繪制出在暴露于aTC繼而暴露于1yMAHL之后表達YFP的細胞百 分比隨時間的圖。
[0086] 圖41E示出了繪制出在暴露于aTC繼而暴露于多種濃度的AHL之后表達YFP的細 胞百分比隨時間的圖。 具體實施方案
[0087] 本文提供了用于在單個細胞中組裝合成邏輯的高效策略和編程語言，所述合成邏 輯伴有DNA編碼的存儲裝置。本文所描述的模塊化DNA組裝策略使得能夠簡單易懂的"即 插即用"編碼邏輯函數，伴隨有源于重組酶能夠將信息"寫入"DNA的能力的存儲?；贒NA 的存儲是長期存儲的有用的實現，因為運貫穿細胞世代自然增殖并且甚至在細胞死亡之后 可W是穩(wěn)定的巧，10]。
[0088] 本發(fā)明的集成邏輯與存儲系統由邏輯口構成，所述邏輯口是包含與輸出核酸（例 如，編碼蛋白產物的基因）W及任選地至少一個單向終止子有效連接或者有條件地有效連 接的各種方向的至少一個啟動子的單基因電路構建體（圖I)。該系統采用化學誘導物輸入 來驅動從誘導型啟動子的正交重組酶的表達。然后重組酶祀向在基因電路構建體中的啟動 子、終止子和/或輸出核酸序列側翼的識別位點用于DNA反向或切除，導致輸出核酸序列的 條件性表達。
[0089] 本發(fā)明的特征在于邏輯口在輸入撤銷之后維持穩(wěn)定的輸出存儲。該特征可W用于 使用高通量測序技術創(chuàng)建具有W多路復用方式詢問狀態(tài)的生物傳感器。此外，本文所提供 的編程語言，其支配基于重組酶之計算的行為，與自動化基因電路設計算法兼容巧2]。
[0090] 邏輯與存儲系統W及邏輯口
[0091] 布爾邏輯函數基于可用于組裝會實現可想到的任何數字部件的函數之組合的邏 輯口。本發(fā)明提供了具有基因（例如重組）事件的穩(wěn)定的基于DNA之存儲的任何布爾邏輯 函數的一步組裝。本發(fā)明考慮了用于在活細胞中集成邏輯與存儲的兩個或更多個基于基因 之邏輯口的組裝。在表1中列出了邏輯口的基礎的"遺傳元件"，并且每個邏輯口包含運些 遺傳元件中的至少兩個的組合。
[0092] 圖2示出了一組邏輯口。圖2中的每個圖（panel)代表了合成邏輯與存儲系統 (總共16個系統/圖）并且每個系統包括（a)包含與編碼Bxbl重組酶的核酸序列有效連 接的N-酷基高絲氨酸內醋（AHL)誘導型啟動子的基因構建體（未描繪），化）包含與編碼 地iC31重組酶的核酸序列有效連接的無水四環(huán)素（aTc)誘導型啟動子的基因構建體（未 描繪），W及（C)(所描繪的）十六個邏輯口中的一個。圖2中的每個圖包括十六個邏輯口 中的一個：NOT、AND、OR、NOT、NOR、NAND、X0R、XN0R、A IMPLY B、B IMPLY A、A NIMPLY B、B NIMPLY A、A、B、FAL沈或TRUE。
[0093] 表I:合成邏輯與存儲系統的遺傳元件的非限制性實例
[0094]
[0095]
[0096]
[0097]
[0098] 依據輸入A和輸入B描述了圖2中的邏輯口。在本文所描述的示例性實施方案 中，輸入A表示將AHL添加到邏輯與存儲系統，其誘導Bxbl重組酶的表達，Bxbl重組酶繼 而催化互補的BxblattB(正向）和BxblattP(反向）重組識別位點的重組（如圖2中S 角形所圖示的）。在本文所描述的示例性實施方案中，輸入B表示將aTc添加到系統，其誘 導地iC31重組酶的表達，地iC31重組酶繼而催化互補的地iC31attB(正向）和地iC31 attP(反向）重組識別位點的重組（如圖2中括號所圖示的）。應當理解的是，AHL和aTc 是本文所描述的邏輯口的輸入的實例。本發(fā)明考慮了使用其他輸入，其他輸入可W由終端 用戶選擇并且可與AHL和aTc互換使用或者代替AHL和aTc。
[0099] 應當理解的是，重組酶Bxbl和地iC31 (及其同源識別位點）是根據本發(fā)明可W使 用的重組酶（及識別位點）的實例。本發(fā)明考慮了使用其他重組酶/識別位點，其他重組 酶/識別位點可W由終端用戶選擇并且可與Bxbl和/或地iC