，由于較大的狀態(tài)圖常?？杀环纸獬奢^小狀態(tài)圖的組合，較小狀態(tài)圖的結果可 W被存儲在存儲器中并且該結果用于后續(xù)計算中，W使不必要的重算最小化。
[0230] 可W對核屯、算法做出改進，W增強算法的靈活性、能力及效率。可W添加其他重組 酶反應（例如整合或雙向反向）或者定義更多調節(jié)元件類型。工具可W被改良成使計算效 率最大化同時限制生物學負載的秩排序設計。因為每個狀態(tài)圖通常具有許多潛在的電路實 現(xiàn)方式，可W基于預期性能給各種實現(xiàn)方式評分。例如，由于DNA剛性對DNA成環(huán)的影響需 要重組酶活性，相比于較長的序列，非常短的DNA序列較低效率地被反向[54]。另外，不同 的重組酶很可能會顯示不同的效率，其可W利用來自例如實施例2的數(shù)據(jù)并入評分標準。
[0231] 實施例4.合成"干細胞"和活細胞中的分化網(wǎng)絡
[0232] 多能干細胞狀態(tài)是高等生物體的生物學的中屯、，但是不存在于單細胞釀酒酵母 (S.cerevisiae)中。為了構建干細胞與分化網(wǎng)絡的模型，使用Gibson和GoldenGateDNA 組裝策略來設計具有干細胞行為的釀酒酵母中的合成電路并且在基因組上集成運些電路 或者將運些電路放置在酵母人工染色體（YAC)中（圖35)。運些電路通過利用子代特異性 啟動子[55, 56](如PSCW11)能夠使干細胞特征性的不對稱細胞分裂。在子代特異性啟動 子的控制下重組酶被表達，W使得重組酶可W在子代細胞中僅不對稱地被表達。運些重組 酶引起從酵母菌干細胞狀態(tài)到下游狀態(tài)的轉變（參見下文）。子代特異性電路被設計成可 誘導用于外部開始并控制"干細胞"實驗。運通過將子代特異性啟動子的輸出設計成控制 下游重組酶表達的誘導型合成轉錄因子（STF)(例如基于TetR或基于LacI的ST巧，修飾子 代特異性啟動子W包含對于誘導型阻遏物的結合位點（例如，TetR或LacI)和/或使用誘 導型重組酶（例如，雌激素誘導型化e)而實現(xiàn)。
[0233] 用巧光蛋白作為輸出并且使用顯微術監(jiān)測細胞巧光譜來表征運些子代特異 性電路的動態(tài)范圍和時間過程。使用圖像處理軟件[57]，確認子代細胞的巧光范圍 (confinement)并且測量其依賴于外部誘導物的濃度和時間。
[0234] 設計合成分化網(wǎng)絡。在添加外部誘導物后，上述的不對稱電路僅在酵母干細胞的 子代中觸發(fā)分化級聯(lián)。合成網(wǎng)絡被改造W引導運些"祖"細胞向下至特定分化途徑。將下述 兩種概念驗證分化網(wǎng)絡用作模型系統(tǒng)：（1) 2至4多路復用電路，其中兩個外部輸入的時序 和標識產生四個不同的巧光蛋白輸出（圖36)W及（2)模擬HSC分化途徑的網(wǎng)絡（圖37)。
[0235] 運些網(wǎng)絡的輸入是控制重組酶表達的外部誘導物。通過表達中間重組酶水平來獲 得隨機切換或者通過表達高重組酶水平誘導切換完成。為了微調重組酶表達，在釀酒酵母 中實現(xiàn)寬動態(tài)范圍（wide-dynamic-range，WDR)正反饋（positivefeeclback，PF')分路模式 (shuntmotif) [5引。具有TetO結合位點的啟動子被設計成表達基于TetON的系統(tǒng)（其中 aTc誘導TetR-VPie與啟動子結合）。該PF-環(huán)被集成或放置到YAC上，W使得其W低拷貝 數(shù)存在。對于分路，改造在高拷貝2微米質粒（2-micronplasmid)上表達巧光蛋白的具有 TetO結合位點的啟動子。類似的策略用于基于異丙基0-D-I-硫代半乳糖巧（IPTG)控制 LacI調控的基因。使用流式細胞儀來驗證WDR電路行為，然后用重組酶替換巧光基因。
[0236] 運些分化網(wǎng)絡的輸出包括不同的報道基因，如巧光基因、比色基因、巧光素酶基 因W及藥物抗性基因。報道分子使得方便對每個狀態(tài)中的細胞種群的比例進行測量。在 其中使用流式細胞儀對例如具有多于=個同時存在的巧光報道分子的單個電路進行多路 復用成像可能具有挑戰(zhàn)性的情況下，使用上面提到的其他報道分子，或者用放置在不同輸 出基因位置中的兩個或=個報道分子建立相同電路的多種版本。輸出還可W是調控內源 途徑或合成途徑的sTF[59-62]。STF可W由鋒指（zincfinger,ZF)、轉錄激活樣效應子 (transcriptionactivator-Ukeeffector,TALE)W及成簇的規(guī)律性間隔的短回文重復 (clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat，CRISPR)牽專錄因子框架 建造并且允許在每個狀態(tài)中可調節(jié)地調控期望的途徑。例如，合成轉錄因子（sT巧可W用 于有差別地調控每個狀態(tài)中的內源途徑（例如，假菌絲生長、交配型、絮凝作用）。
[0237] 可W使用上述來自算法的重組酶電路的多種不同的實現(xiàn)方式，由此能夠在性能不 足的例子中提供多種有效的替選方案。還可W使用手動設計的電路。一些設計可W編碼由 用于反向或切除的同一重組酶識別的多個RRS對。為了降低不想要的RRS之間的串擾，可 W設計除了分享相同序列還具有其突變的中央二核巧酸殘基的RRS。還示出了包含相同中 央二核巧酸的RRS對優(yōu)選地相互反應[64-66]。此外，作為經(jīng)由PF分路WDR對數(shù)電路表達 重組酶的替選方案，可W使用經(jīng)線性化的轉錄電路[67]。運些負反饋電路使得能夠用外部 誘導物線性控制輸出基因。還已經(jīng)開發(fā)在LCP上不需要正反饋（P巧組件并且在分開的HCP 上不需要分路組件的大腸桿菌中的WDR對數(shù)電路值aniel，Rubens等在制備中的）；然而， 運些組件兩者可W在同一載體上。運通過PF和分路的誘變而實現(xiàn)。
[023引表征合成的分化網(wǎng)絡。通過誘導具有不同時序的不同重組酶的表達來測試分化網(wǎng) 絡（圖37)。探索重組酶表達的排列并且用流式細胞術、顯微術、PCR及DNA測序來監(jiān)測狀 態(tài)及轉變。根據(jù)電路拓撲W及輸入的時間動態(tài)確定狀態(tài)轉變的效率如何W及每個狀態(tài)的穩(wěn) 定性如何。用WDR電路表達低水平的重組酶、中間水平的重組酶及高水平的重組酶W確定 不同的水平如何影響狀態(tài)轉變的保真性和隨機性。中間水平的重組酶表達可導致混合的 群。作為延伸，探索經(jīng)由表達重組酶加上重組酶定向因子（畑巧恢復反向的方向如何影響 狀態(tài)機的行為[63]。該工作提供復雜的合成分化網(wǎng)絡的第一個示范，同時有可W用于調節(jié) 行為的多個旋鈕。
[0239] 實例5.狀態(tài)機電路
[0240] 本文提供了可W用于構建生物學電路的邏輯與存儲系統(tǒng)，從而能夠用簡單的狀態(tài) 機表示對復雜系統(tǒng)建模（例如根據(jù)計算機科學）。例如，本發(fā)明的邏輯與存儲系統(tǒng)可W用 于根據(jù)輸入（例如基于化學的輸入或基于重組酶的輸入）的標識及順序使細胞在獨特的狀 態(tài)之間轉變。關于此的一個非限制性實例是n個輸入至化個輸出的電路，運使得能夠基于 所使用的n個輸入的組合選擇化個輸出中的一個（圖38A至38E、圖39A至39C)。一般而 言，狀態(tài)機概念是可擴展的并能夠使n個輸入一 2"個輸出。
[0241] 圖38A中圖示解了該實例中所使用的邏輯口。邏輯口 1包含兩個輸出核酸，其中 一個編碼藍色巧光蛋白度F巧而另一個編碼黃色巧光蛋白（YFP)。同源地iC31重組酶識別 位點（RR巧用括號表示，而同源BxblRRS用S角形表示。邏輯口 2類似地包含兩個輸出核 酸，其中一個編碼紅色巧光蛋白（RF巧而另一個編碼綠色巧光蛋白（GFP)。邏輯口 1和邏輯 口 2在本文中被稱為"四色系統(tǒng)"。
[0242] 在一個實驗中，用包含四色系統(tǒng)和兩個重組酶的質粒轉化細胞，其中兩個重組酶 是分別在阿拉伯糖誘導型啟動子和IPTG誘導型啟動子的控制下的化iC31重組酶和Bxbl重組酶（圖38B)。在沒有誘導物的情況下使細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜然后暴露于僅IPTG、 IPTG然后阿拉伯糖、阿拉伯糖或者阿拉伯糖然后IPTG(圖38)。圖38示出了暴露于僅IPTG 的細胞中的RFP的巧光、暴露于IPTG然后阿拉伯糖的細胞中的GFP的巧光、暴露于僅阿拉 伯糖的細胞中的BFP的巧光W及暴露于阿拉伯糖然后IPTG的細胞中的YFP的巧光。
[0243] 在另一個實驗中，用包含四色系統(tǒng)和兩個重組酶的質粒轉化細胞，其中兩個重組 酶是在核糖核酸調節(jié)子控制下的化iC31重組酶和Bxbl重組酶（圖39A)。在沒有誘導物 (aTc和AHL)的情況下使細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，第二天將細胞離屯、、洗涂并按1 : 2000 稀釋。細胞分別暴露于50ng/ml、20化g/ml及25化g/ml濃度的一種輸入誘導物aTc，持續(xù) 2、4、6、8、10、12及14小時。然后使用流式細胞術測量BFP的表達。還通過PCR確認輸出核 酸表達（數(shù)據(jù)未示出）。圖40A至40D示出了繪制在多種輸入濃度下表達BFP的細胞百分 比隨時間的圖。
[0244] 然后將用aTC誘導過夜的細胞離屯、、洗涂并按1 : 2000稀釋并且分別暴露于 1yM、10yM、50yM及IOOyM濃度的另一種誘導物AHL，持續(xù)2、4、6、8、10、12及14小時。 然后使用流式細胞術測量YFP的表達。還通過PCR確認輸出核酸表達（數(shù)據(jù)未示出）。圖 41A至41E示出了繪制在各種輸入濃度下表達YFP的細胞百分比隨時間的圖。
[0245] 實驗方法
[0246] 在按下述濃度使用適當抗生素的Luria-Bertani(LB)-Miller培養(yǎng)基 (Fisher#BP1426-2)中進行所有的實驗：簇節(jié)青霉素（50yg/ml)，卡那霉素（30yg/ml)W 及氯霉素（25yg/nd)。
[0247] 基于重組酶的計算質粒構建體
[024引使用基礎的分子克隆技術巧7]和Gibson組裝巧引構建所有質粒。使用化W化glandBiol油(肥B)限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶W及P掃USION?PCR試劑盒。 利用具有雙48/48快速反應模塊的Bio-RadS1000?熱循環(huán)儀度ioRad)進行聚合酶鏈式反 應（PCR)。由IntegratedDNATechnologies(Coralville，IA)構建包含重組酶識別位點 的定制序列。
[0249]所有質粒均使用標準方案轉化到大腸桿菌菌株D冊a巧RO(F-1巧80lacZA：M15AQacZYA-ar評）U169deoRrecAlendAlhsdR17(rk-，址+)地oASU祀44thi-1gyrA96 relAlA-，PN25/tetR，Placiq/lacI，Sp;r)并用QIAprep'"SpinMiniprepKits(Qiagen) 分離。通過限制性消化并且由Genewiz(Cambridge,MA)測序確認質粒修飾。
[0巧0] 通過由化Ol和化nl切除來移除PZA31G中存在的啟動子化tetO-1和核糖體結合 位點（RB巧并且用相同的RBS和EagI限制位點進行替換。然后將位于識別位點間的啟動 子和/或終止子和未定位在識別位點之間的下游奸P組成的基于重組酶的計算設備的所有 組件Gibson組裝在PZA31GCmR中的AatII限制位點與化Ol限制位點之間。所有其他設 計（即包括定位在識別位點之間的奸P的那些組件）被Gibson組裝在AatII限制位點與 AvrII限制位點之間。
[0巧。Bxb1基因被克隆到來自化11ura等的核糖核酸調節(jié)子載體rrjC12y(rii)g之變體 的限制位點化nl與HindIII之間巧9, 30]。該高拷貝數(shù)質粒包含卡那霉素抗性W及驅動 taRNA(反式激活RNA)版本taRl巧和Bxbl轉錄的PLuxI啟動子。Bxbl基因具有RBS上游 的CrRl巧順式抑制序列。
[0巧引 地iC31基因獲自Addgene質粒18941 (Cambridge,MA)。將地iC31基因克隆到來 自Callura等的核糖核酸調節(jié)子載體rrjcl2y(11)g之變體的限制位點化nl與PstI之間 巧9, 30]。該中拷貝數(shù)質粒包含簇節(jié)青霉素抗性W及驅動兩個taRNA版本taR12和地iC31 轉錄的化tetO-1啟動子。地iC31基因具有RBS上游的crR12順式抑制序列。
[0巧3] Gibson組裝
[0254] Gibson組裝用于將啟動子（proD) [5]、終止子（Tl) [6]W及輸出基因（g巧）[6]模 塊連接在一起（表2)W在單步反應中實現(xiàn)集成邏輯與存儲的質粒。
[0巧5] 經(jīng)設計包含提供與相鄰片段重疊之序列的"突出物"的PCR引物通過PCR構建序 列重疊約40堿基的DNA片段。遵循Gibson等人所描述的方案巧引。簡言之，通過添加W下物質來制備Gibson組裝主體混合物（mastermix) :320JiL的5XISO緩沖液、0.64JiL的 IOU/yL巧核酸外切酶、20yL的 2U/yLPHUSIONS諫合酶、160yL的 40U/yLhq 連接酶，并將其用水補足1. 2mL。準備15yL的等分試樣并用于單個Gibson反應。接下來， 將10化g的線性載體骨架W及等摩爾量的其他組裝件添加到15yL主體混合物，20yL總體 積組裝反應混合物。組裝反應在50°C解育60分鐘，并且5yL的裝配反應物轉化到100yL 的感受態(tài)大腸桿菌中。
[0巧6] 基于重組酶計算流式細胞儀測量結果
[0257] 在進行流式細胞儀測量之前，細胞在無誘導物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜并且然后如 所指示的，在具有最終濃度為20ng/mL的誘導物無水四環(huán)素（Sigma)和/或最終濃度為IyM的N-酷基高絲氨酸內醋（AHL)的培養(yǎng)基中按1 : 1000稀釋。在誘導物作用下培養(yǎng) 細胞4小時，將細胞洗涂，按1 : 1000稀釋并且在誘導物作用下在37°C、300rpm下培養(yǎng)過 夜。接下來，在沒有誘導物的情況下，細胞在培養(yǎng)基中離屯、并且洗涂。然后，細胞按1 : 100 稀釋到包含新鮮的IX憐酸鹽緩沖鹽水（PBS)的新的96孔板中并且立即使用抓-FACS LSRFortessa-HTS細胞分析儀度Dbiosciences，CA)進行測定。FlowJo(Treestar)OR)用 于數(shù)據(jù)分析及可視化。用488nm的氣激光器激發(fā)W及515nm至545nm發(fā)射濾光片測量巧光。 為了確保樣品之間的一致性，針對每個樣品采集50, 000個細胞并且設口。應用一致的闊值 來確定認為GFP陽性（ON狀態(tài)）或者GFP陰性（OFF狀態(tài)）的細胞百分比（圖5)。經(jīng)過S 次獨立實驗對表達GFP的細胞百分比進行平均。誤差條表示均值的標準誤差。
[0巧引經(jīng)過多代的穩(wěn)定存儲維持
[0259] 為了研究我們的基于重組酶的存儲設備的時間穩(wěn)定性，如上面所述的包含AND口 的細胞被從OFF誘導成ON。然后運些細胞在沒有誘導物的培養(yǎng)基中每天重復培養(yǎng)并且按 1 : 2000稀釋，持續(xù)9天，W實現(xiàn)每天約11代。如本文所述的，使用流式細胞術通過測量綠 色巧光蛋白的表達分別監(jiān)測細胞維持其狀態(tài)的能力。本發(fā)明的邏輯與存儲系統(tǒng)保持狀態(tài)持 續(xù)至少約90次細胞倍增。運些數(shù)據(jù)表明該系統(tǒng)的長期的運行穩(wěn)定性。
[0260] 細胞死亡之后的穩(wěn)定存儲維持
[0261] 包含NOR口的細胞暴露于沒有輸入、僅AHL、僅aTcW及AHL和aTc兩者過夜，離 屯、、洗涂然后通過使它們暴露于90°C持續(xù)30分鐘將其殺死。根據(jù)制造商的說明書使用 -JPHUSION漫)PCR試劑盒（New化glandBiol油）對從死亡細胞分離的DM進行PCR。利 用具有雙48/48快速反應模塊的Bio-RadS1000?熱循環(huán)儀度ioRad)進行PCR。在1%的 瓊脂糖凝膠上通過電泳分析PCR產物。
[0262] 圖4中所使用的特定引物：
[026引 Pl:GGCGCGTACTCCTAAGAAAC(沈QIDNO:1)
[0264] P2:TCTCCGTCGTCAGGATCATC(沈QIDNO: 2)
[026引 P3:ATTAAAGAGGAGAAAGGTACCATGC(沈QIDNO : 3)
[0266] P4:AAAGTTAAACAAAATTATTTGTAGAGGG(沈QIDNO:4)
[0267] 表2.用于實現(xiàn)集成邏輯與存儲的合成部件 [026引
[0269]
[0270]
[0271] 參考文獻：?下參考文獻中的每一個均通過引用并入本文。 1 1.Hasty，J.，McMillen,D.feCollins，J.J.Engineeredgenecircuits.Nature
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