31互換使用或者代替Bxbl 和/或地iC31W催化DNA的反向或切除。下面描述了其他重組酶/識(shí)別位點(diǎn)的實(shí)例。此 夕F，雖然圖2中所描繪的輸出核酸序列奸P編碼蛋白產(chǎn)物綠色巧光蛋白（GFP)，但應(yīng)當(dāng)理解 的是，g巧可W由任何輸出核酸序列代替。
[0100]下面描述了本發(fā)明的十六個(gè)邏輯口（AND、0R、N0TA、N0TB、N0R、NAND、X0R、XN0R、A IMPLYB、BIMPLYA、ANIMPLYB、BNIMPLYA、A、B、FAL沈和TRUE),運(yùn)提供了所有二輸入 布爾邏輯函數(shù)。包含"二輸入"布爾邏輯函數(shù)的邏輯口包含AND、OR、NOR、NAND、XOR、XNOR、 AIMPLYB、BIMPLYA、ANIMPLYB及BNIMPLYA。因此，如果邏輯口或多個(gè)邏輯口包含 AND、0R、N0R、NAND、X0R、XN0R、AIMPLYB、BIMPLYA、ANIMPLYB及BNIMPLYA邏輯口， 則邏輯口或多個(gè)邏輯口被認(rèn)為提供所有二輸入布爾邏輯函數(shù)。然而，本發(fā)明的獨(dú)立邏輯口 不限于圖2中所描繪的基因電路構(gòu)建體。任何數(shù)量的表1中的遺傳元件可W在邏輯口的給 定的基因電路構(gòu)建體中W多種位置和方向被布置W獲得期望的輸出。例如，圖3中描繪了 邏輯口NOR、AND及XOR的替選基因電路構(gòu)建體。
[0101] 在本文中，當(dāng)啟動(dòng)子相對(duì)于其調(diào)節(jié)的核酸序列處在正確的功能位置及方向W控制 ("驅(qū)動(dòng)"）該序列的轉(zhuǎn)錄起始和/或表達(dá)時(shí)，啟動(dòng)子被認(rèn)為是"有效連接的"。當(dāng)在基因重 組事件后啟動(dòng)子相對(duì)于其調(diào)節(jié)的核酸序列被放置在正確的功能位置及方向時(shí)，啟動(dòng)子被認(rèn) 為是"有條件地有效連接的"。
[0102] "反向的"遺傳元件（例如，反向的啟動(dòng)子、反向的終止子、反向的輸出核酸序列） 是反方向的遺傳元件，W使得曾經(jīng)的編碼（有義）鏈現(xiàn)在是非編碼（反義）鏈。處于其反 向的（反方向）遺傳元件是非功能性的（例如，未與另一遺傳元件如輸出核酸序列有效連 接）。當(dāng)側(cè)翼的互補(bǔ)識(shí)別位點(diǎn)重組W及隨后遺傳元件變回其正確方向后，遺傳元件的功能可 恢復(fù)。因此，如果啟動(dòng)子在側(cè)翼的互補(bǔ)識(shí)別位點(diǎn)重組后被定向成使得曾經(jīng)的非編碼鏈現(xiàn)在 是編碼鏈，并且啟動(dòng)子能夠控制輸出核酸序列的轉(zhuǎn)錄起始和/或表達(dá)，則側(cè)翼有重組識(shí)別 位點(diǎn)的反向啟動(dòng)子可W被認(rèn)為是與下游輸出核酸序列"有條件地有效連接"。同樣地，如果 輸出核酸序列在側(cè)翼的識(shí)別位點(diǎn)的重組后被定向成使得曾經(jīng)的非編碼鏈現(xiàn)在是編碼鏈，并 且上游啟動(dòng)子能夠控制輸出核酸的轉(zhuǎn)錄起始和/或表達(dá)，則側(cè)翼有重組識(shí)別位點(diǎn)的反向輸 出核酸序列可與上游啟動(dòng)子"有條件地有效連接"。在圖2的NOR、NAND、TRUE、NOTA、NOTB 及XNOR邏輯口中示出了與輸出核酸序列有效連接的啟動(dòng)子的示例性實(shí)例。在圖2的AND、 OR、A、B、ANIMPLYB、BNIMPLYA及XOR邏輯口中示出了與輸出核酸序列有條件地有效連 接的啟動(dòng)子的示例性實(shí)例。邏輯口AIMPLYB和BIMPLYA包含與輸出核酸序列有效連接 的啟動(dòng)子和與輸出核酸序列有條件地有效連接的啟動(dòng)子兩者。
[0103] 在本文中，如果輸出核酸序列位于近編碼（有義）鏈的3'端而遺傳元件位于近編 碼（有義）鏈的5'端，則輸出核酸序列被認(rèn)為是遺傳元件的下游。一個(gè)遺傳元件被認(rèn)為是 另一個(gè)遺傳元件的"緊接下游"，則兩個(gè)遺傳元件彼此接近（例如，沒有其他遺傳元件（如表 1中所列出的那些遺傳元件）位于運(yùn)兩個(gè)遺傳元件之間）。
[0104]NOT口
[0105] 最簡(jiǎn)單的布爾邏輯口是指NOT口。該NOT口接受一個(gè)輸入并且產(chǎn)生與其相反的輸 出。本文所公開的是示例性的NOTA邏輯口和NOTB邏輯n，其中A(AHL)和B(aTc)是輸 入（圖2)。圖2中的NOTA口包含與輸出核酸序列奸P有效連接的側(cè)翼有互補(bǔ)的重組酶識(shí) 別位點(diǎn)BxblattB和BxblattP的組成型啟動(dòng)子（本文中簡(jiǎn)稱為啟動(dòng)子）。當(dāng)AHL添加到 系統(tǒng)時(shí)，表達(dá)Bxbl重組酶，并且BxblattB和BxblattP重組，導(dǎo)致奸P反向，使得奸P的 轉(zhuǎn)錄不再受啟動(dòng)子控制。相反地，當(dāng)aTc而非AHL添加到系統(tǒng)時(shí)，不表達(dá)Bxbl重組酶，Bxbl at巧和Bxblat巧不重組，并且啟動(dòng)子控制奸P轉(zhuǎn)錄。因此，僅在不存在AHL時(shí)表達(dá)GFP。
[0106] 圖2中的NOTB口包含側(cè)翼有互補(bǔ)的重組酶識(shí)別位點(diǎn)地iC31attB和地iC31attP 并且與奸P有效連接的啟動(dòng)子。當(dāng)aTc添加到系統(tǒng)時(shí)，表達(dá)地iC31重組酶，并且地iC31 attB和地iC31attP重組，導(dǎo)致啟動(dòng)子反向，使得啟動(dòng)子不再控制奸P的轉(zhuǎn)錄。相反地，當(dāng) AHL而非aTc添加到系統(tǒng)時(shí)，不表達(dá)地iC31重組酶，地iC31at巧和地iC31at巧不重組， 并且啟動(dòng)子控制奸P轉(zhuǎn)錄。因此，僅在不存在aTc時(shí)表達(dá)GFP。
[0107]AND口
[010引AND口是另一種簡(jiǎn)單的布爾邏輯口。AND口對(duì)兩個(gè)輸入A和B進(jìn)行邏輯"與"運(yùn) 算。圖2中的AND口包含與側(cè)翼有BxblattB和BxblattP的反向奸P有條件地有效連接 的側(cè)翼有地iC31attB和地iC31attP的反向啟動(dòng)子。當(dāng)僅AHL添加到系統(tǒng)時(shí)，表達(dá)Bxbl 重組酶，并且BxblattB和BxblattP重組W定向奸P沿著編碼鏈的5'至3'方向；然而， 在沒有aTc激活地iC31attB和地iC31attP的重組的情況下，啟動(dòng)子保持反向并且不能 控制奸P轉(zhuǎn)錄。類似地，當(dāng)僅aTc添加到系統(tǒng)時(shí)，表達(dá)地iC31重組酶，并且地iC31at巧和 地iC31attP重組W定向啟動(dòng)子沿著編碼鏈的5'至3'方向；然而，在沒有AHL激活Bxbl attB和BxblattP的重組的情況下，g巧保持反向。因此，僅在AHL和aTc兩者都存在的情 況下表達(dá)GFP。
[0109] OR口
[0110]OR口對(duì)輸入A或輸入B進(jìn)行邏輯"或"運(yùn)算。圖2中的OR口包含側(cè)翼有地iC31 attB和曲iC31attP之反向啟動(dòng)子上游的側(cè)翼有BxblattB和化blat巧之反向啟動(dòng)子，各 反向啟動(dòng)子與奸P有條件地有效連接。當(dāng)AHL添加到系統(tǒng)時(shí)，表達(dá)Bxbl重組酶，并且Bxbl at巧和Bxblat巧重組W定向啟動(dòng)子沿著編碼鏈的5'至3'方向來(lái)控制奸P轉(zhuǎn)錄。類似 地，當(dāng)aTc添加到系統(tǒng)時(shí)，表達(dá)地iC31重組酶，并且地iC31at巧和地iC31at巧重組W定 向另一啟動(dòng)子沿著編碼鏈的5'至3'方向來(lái)控制奸P轉(zhuǎn)錄。因此，在AHUaTc或兩者都存 在的情況下表達(dá)GFP。
[0111]NORn
[011引NOR口是OR口與NOT口的組合。圖2中的NOR口包含與奸P有效連接的啟動(dòng)子W及位于其間的兩個(gè)反向終止子，每個(gè)終止子的側(cè)翼有不同的互補(bǔ)重組酶識(shí)別位點(diǎn)。當(dāng)AHL 添加到系統(tǒng)時(shí)，表達(dá)Bxbl重組酶，并且Bxblat巧和Bxblat巧重組W定向終止子沿著編 碼鏈的5'至3'方向，從而終止奸P轉(zhuǎn)錄。類似地，當(dāng)aTc添加到系統(tǒng)時(shí)，表達(dá)地iC31重 組酶，并且地iC31at巧和地iC31at巧重組W定向另一終止子沿著編碼鏈的5'至3'方 向，從而再次終止奸P轉(zhuǎn)錄。因此，僅在AHL和aTc兩者都不存在的情況下表達(dá)GFP。
[0113] MND口
[0114] NAND口是AND口與NOT口的組合。圖2中的NAND口包含與奸P有效連接的兩 個(gè)啟動(dòng)子，每個(gè)啟動(dòng)子側(cè)翼有不同的互補(bǔ)重組酶識(shí)別位點(diǎn)。當(dāng)僅AHL添加到系統(tǒng)時(shí)，表達(dá) Bxbl重組酶，并且BxblattB和BxblattP重組W使上游啟動(dòng)子反向；然而，在沒有aTc激 活地iC31attB和地iC31attP的重組的情況下，下游啟動(dòng)子仍然與奸P有效連接并且控 制奸P轉(zhuǎn)錄。類似地，當(dāng)僅aTc添加到系統(tǒng)時(shí)，表達(dá)地iC31重組酶，并且地iC31at巧和 地iC31attP重組W使下游啟動(dòng)子反向；然而，在沒有AHL激活BxblattB和BxblattP的 重組的情況下，上游啟動(dòng)子仍然與奸P有效連接并且控制奸P轉(zhuǎn)錄。當(dāng)AHL和aTc兩者都 添加至系統(tǒng)時(shí)，兩個(gè)啟動(dòng)子都反向并且都不控制奸P轉(zhuǎn)錄。因此，只要AHL和aTc不同時(shí)存 在于系統(tǒng)中，就表達(dá)GFP。
[0115] XOR口
[0116] XOR口是"異或"口。圖2中的XOR口包含與奸P有條件地有效連接并且側(cè)翼有 Bxblat1:B和Bxblat1:PW及地iC31at1:B和地iC31at1:P的反向啟動(dòng)子。當(dāng)僅AHL添加 到系統(tǒng)時(shí)，表達(dá)Bxbl重組酶，并且BxblattB和BxblattP重組W定向啟動(dòng)子沿著編碼鏈 的5'至3'方向來(lái)控制奸P轉(zhuǎn)錄。類似地，當(dāng)僅aTc添加到系統(tǒng)時(shí)，表達(dá)地iC31重組酶， 并且地iC31attB和地iC31attP重組W定向啟動(dòng)子著編碼鏈的5'至3'方向來(lái)控制奸P 轉(zhuǎn)錄。相對(duì)地，當(dāng)AHL和aTc兩者都添加到系統(tǒng)時(shí)，發(fā)生下述兩個(gè)重組事件：首先定向啟動(dòng) 子沿著編碼鏈的5'至3'方向，然后使啟動(dòng)子反向回到沿非編碼鏈的無(wú)效位置（不能控制 奸P轉(zhuǎn)錄）。因此，僅在AHL或aTc存在于系統(tǒng)中時(shí)表達(dá)GFP，但在AHL和aTc兩者都存在時(shí) 不表達(dá)GFP。
[0117] XNOR口
[0118] XNOR口是"異或非"口。圖2中的XNOR口包含與奸P有效連接并且側(cè)翼有Bxbl attB和BxblattPW及地iC31attB和地iC31attP的啟動(dòng)子。當(dāng)僅AHL添加到系統(tǒng)時(shí)， 表達(dá)Bxbl重組酶，并且BxblattB和BxblattP重組W使奸P反向沿著非編碼鏈，運(yùn)種情 況下奸P不受啟動(dòng)子的控制。類似地，當(dāng)僅aTc添加到系統(tǒng)時(shí)，表達(dá)地iC31重組酶，并且 地iC31attB和地iC31attP重組W使奸P反向沿著非編碼鏈。相對(duì)地，當(dāng)AHL和aTc兩者 都添加到系統(tǒng)時(shí)，下述兩個(gè)重組事件發(fā)生：首先使奸P反向沿著非編碼鏈，然后定向奸P回 到沿編碼鏈的有效的位置，現(xiàn)在奸P受啟動(dòng)子控制。因此，在AHL和aTc兩者都存在于系統(tǒng) 中時(shí)或者在AHL和aTc兩者都不存在于系統(tǒng)中時(shí)表達(dá)GFP。
[0119]IMPLY口
[0120] 本發(fā)明還提供了AIMPLYB口（AANDNOTB)和BIMPLYA度ANDNOTA)。圖 2 中的AIMPLYB口包含側(cè)翼有BxblattB和BxblattP(與奸P有效連接）的啟動(dòng)子W及 位于所述啟動(dòng)子與奸P之間的側(cè)翼有地iC31attB及地iC31attP(與奸P有條件地有效 連接）的反向啟動(dòng)子。當(dāng)AHL添加到系統(tǒng)時(shí)，上游啟動(dòng)子是反向的并且奸P不轉(zhuǎn)錄。當(dāng)aTc 添加到系統(tǒng)時(shí)，下游啟動(dòng)子被定向成沿著編碼鏈的5'至3'方向來(lái)控制奸P轉(zhuǎn)錄。因此， 在aTc存在，AHL和aTc兩者都存在或者AHL和aTc兩者都不存在的情況下表達(dá)GFP;然而， 在僅AHL存在的情況下不表達(dá)GFP。
[0121] 相對(duì)地，圖2中的BIMPLYA口包含位于側(cè)翼有地iC31attB及地iC31attP(與 奸P有效連接）之啟動(dòng)子上游的側(cè)翼有BxblattB和BxblattP(與奸P有條件地有效連 接）的反向啟動(dòng)子。當(dāng)AHL添加到系統(tǒng)時(shí)，上游啟動(dòng)子被定向成沿著編碼鏈的5'至3'方 向來(lái)控制奸P轉(zhuǎn)錄。當(dāng)aTc添加到系統(tǒng)時(shí)，下游啟動(dòng)子是反向的并且奸P不轉(zhuǎn)錄。因此，在 AHL存在，AHL和aTc兩者都存在或者AHL和aTc兩者都不存在的情況下表達(dá)GFP;然而，在 僅aTc存在的情況下不表達(dá)GFP。
[012引NIMPLY口
[0123] 本發(fā)明還提供了ANIMPLYB口和BNIMPLYA口。圖2中的ANIMPLYB口包含側(cè) 翼有地iC31at1:B及地iC31at1:P并且與側(cè)翼有Bxblat1:B和Bxblat1:P的反向奸P有條 件地有效連接的啟動(dòng)子。當(dāng)aTc添加到系統(tǒng)時(shí)，上游啟動(dòng)子是反向的并且奸P不轉(zhuǎn)錄。當(dāng) AHL添加到系統(tǒng)時(shí)，g巧被定向成沿著編碼鏈的5'至3'方向并且被轉(zhuǎn)錄。因此，在僅AHL 存在的情況下表達(dá)GFP。
[0124] 相反地，BNIMPLYA口包含側(cè)翼有地iC31attB和地iC31attP并且與奸P有條 件地有效連接的反向啟動(dòng)子W及位于反向啟動(dòng)子與奸P之間的側(cè)翼有BxblattB和Bxbl attP的反向終止子。當(dāng)aTc添加到系統(tǒng)時(shí)，上游啟動(dòng)子被定向成沿著編碼鏈的5'至3'方 向并且奸P被轉(zhuǎn)錄。當(dāng)AHL添加到系統(tǒng)時(shí)，終止子被定向成沿著編碼鏈的5'至3'方向并 且奸P不被轉(zhuǎn)錄。因此，在僅aTc存在的情況下表達(dá)GFP。
[012引A口和B口
[0126] 本發(fā)明還提供了A口和B口。圖2中的A口包含與側(cè)翼有BxblattB和BxblattP 的反向奸P有條件地有效連接的啟動(dòng)子。在AHL存在于系統(tǒng)中時(shí)表達(dá)GFP。圖2中的B口 包含側(cè)翼有地iC31attB及地iC31attP且有與奸P條件地有效連接的反向啟動(dòng)子。在 aTc添加至系統(tǒng)時(shí)表達(dá)GFP。
[0127]TRUE口和FALSE口
[0128] 本發(fā)明還提供了TRUE口和FALSE口。圖2中的TRUE口包含與奸P有效連接的啟 動(dòng)子。GFP獨(dú)立于系統(tǒng)的輸入而被表達(dá)。本發(fā)明的FALSE口包含緊接反向啟動(dòng)子下游（例 如，與反向啟動(dòng)子相鄰）的奸P。GFP從不被表達(dá)，并且運(yùn)也獨(dú)立于系統(tǒng)的輸入。
[0129] 重組酶及重組識(shí)別序列
[0130] 本文提供了用于向本發(fā)明的邏輯與存儲(chǔ)系統(tǒng)賦予穩(wěn)定的基于DNA之存儲(chǔ)的重組 酶。本文所使用的"重組酶"是識(shí)別短DNA序列的位點(diǎn)特異性酶，所述短DNA序列通常為約 30堿基對(duì)化P)至40bp，并且其介導(dǎo)運(yùn)些重組酶識(shí)別序列之間的重組，運(yùn)導(dǎo)致重組酶識(shí)別序 列之間的DNA片段的切除、整合、反向或交換。本文所使用的"遺傳元件"指定是在基因表 達(dá)中發(fā)揮作用的DM序列。例如，啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子化及編碼產(chǎn)物（例如蛋白產(chǎn)物）的核 酸均被認(rèn)為是遺傳元件。
[0131] 重組酶可W基于不同的生化特性被分類成兩個(gè)不同的家族：絲氨酸重組酶（例 如，解離酶和轉(zhuǎn)化酶）和酪氨酸重組酶（例如，整合酶）。絲氨酸重組酶和酪氨酸重組酶還被 劃分成雙方向重組酶和單方向重組酶。雙方向絲氨酸重組酶的實(shí)例包括但不限于P-six、 Ci址、ParA及丫 6,而單方向絲氨酸重組酶的實(shí)例包括但不限于BxbUd)C31、TP901、TGl、 巧投Tl、R4、9RV.l、（pFCl、MRll、A118、U153及甜29。雙方向酪氨酸重組酶的實(shí)例包 括但不限于化e、化P及R，而單方向酪氨酸重組酶的實(shí)例包括但不限于A、HK101、HK022及PSAM2。絲氨酸重組酶和酪氨酸重組酶命名源自重組酶用來(lái)攻擊DNA并且在鏈交換期間變 成與DNA共價(jià)鏈接的保守的親核氨基酸殘基。重組酶已經(jīng)用于多種標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)應(yīng)用，包括 創(chuàng)建基因敲除和解決分選問(wèn)題巧5-38]。
[0132] 重組的結(jié)果部分取決于待被重組的通常小于30bp長(zhǎng)的兩個(gè)短重復(fù)DNA序列的位 置和方向。重組酶與運(yùn)些重復(fù)序列結(jié)合，運(yùn)些重復(fù)的序列對(duì)每個(gè)重組酶是特異的，并且在本 文中被稱為"重組酶識(shí)別序列"或"重組酶識(shí)別位點(diǎn)"。因此，如本文所使用的，當(dāng)重組酶可 介導(dǎo)重復(fù)DNA序列之間的反向或切除時(shí)，重組酶對(duì)于重組酶識(shí)別位點(diǎn)是"特異的"。如本文 所使用的，還可W認(rèn)為重組酶識(shí)別其"同源重組酶識(shí)別位點(diǎn)"，所述同源重組酶識(shí)別位點(diǎn)在 間插的遺傳元件（例如，啟動(dòng)子、終止子或輸出核酸序列）的側(cè)翼。當(dāng)該元件位于兩個(gè)重復(fù) 的DNA序列之間并且緊鄰運(yùn)兩個(gè)重復(fù)的DNA序列時(shí)，遺傳元件被認(rèn)為是"側(cè)翼"有重組酶識(shí) 別位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，重組酶識(shí)別位點(diǎn)不彼此重疊。然而，在另一些實(shí)施方案中，重 組酶識(shí)別位點(diǎn)彼此重疊，如下文所描述的（參見，例如，實(shí)施例5中所描述的電路），運(yùn)使得 極大地提高了組合復(fù)雜性。
[0133] 反向重組發(fā)生在兩個(gè)短的反向的重復(fù)的DNA序列之間。由DNA彎曲蛋白值NA bendingprotein)輔助的DNA環(huán)形成將兩個(gè)重復(fù)的序列帶到一起，此時(shí)發(fā)生DNA切割和連 接。運(yùn)種反應(yīng)不依賴ATP并且需要超螺旋DNA。運(yùn)樣的反向重組事件的最終結(jié)果是重復(fù)位 點(diǎn)之間的DNA段（stretch)反向（即DNA段反轉(zhuǎn)方向）使得曾經(jīng)的編碼鏈現(xiàn)在是非編碼鏈 而曾經(jīng)的非編碼鏈現(xiàn)在是編碼鏈。在運(yùn)樣的反應(yīng)中，在沒有DNA的凈增益或損失的情況下 DNA守恒。
[0134] 相反，整合（切除）重組發(fā)生在W相同方向定向的兩個(gè)短的重復(fù)的DNA序列之間。 運(yùn)種情況下，切離/移除間插的DNA。例如，AND口可如下組裝，通過(guò)將終止子放置在定向成 用于切除的兩個(gè)不同的重組酶位點(diǎn)組中的每組之間并且側(cè)翼有啟動(dòng)子和輸出如GFP編碼 序列。在運(yùn)個(gè)實(shí)例中，必須由重組酶的輸入依賴的作用來(lái)切除兩個(gè)終止子，W允許從啟動(dòng)子 到GFP編碼序列的連讀。因此，需要兩個(gè)輸入來(lái)切除運(yùn)兩個(gè)終止子W產(chǎn)生輸出。
[0135] 重組酶還可W被分類為不可逆或可逆的。如本文所使用的，"不可逆重組酶"指的 是可催化兩個(gè)互補(bǔ)的重組位點(diǎn)之間的重組，但是在沒有附加因素輔助的情況下不能催化由 該重組形成的雜交位點(diǎn)之間的重組的重組酶。因此，"不可逆識(shí)別位點(diǎn)"指的是可充當(dāng)不可 逆重組酶的兩個(gè)DNA識(shí)別序列中的第一個(gè)并且在該位點(diǎn)重組之后被修飾成雜交識(shí)別位點(diǎn) 的重組酶識(shí)別位點(diǎn)。"互補(bǔ)性不可逆識(shí)別位點(diǎn)"指的是可充當(dāng)不可逆重組酶的兩個(gè)DNA識(shí) 別序列中的第二個(gè)并且在該位點(diǎn)同源重組之后被修飾成雜交重組位點(diǎn)的重組酶識(shí)別位點(diǎn)。 例如，下面所描述的at巧和at巧是Bxbl和地iC31重組酶的不可逆重組位點(diǎn)，其中attB 是attP的互補(bǔ)性不可逆重組位點(diǎn)，反之亦然。近年來(lái)，已經(jīng)表明，attB/attP位點(diǎn)可被突變W創(chuàng)建僅彼此相互作用而不與其他突變體相互作用的正交B/P對(duì)（odhogonalB/Ppair) [72]。運(yùn)使得單個(gè)重組酶可控制多個(gè)正交B/P對(duì)的切除、整合或反向。
[0136] 地iC31 (巧€31)整合酶例如在不存在真核細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的附加因素的情況下僅 催化attBXattP反應(yīng)。重組酶不能介導(dǎo)attB與attP之間重組后形成的雜交重組位點(diǎn)attL與attR之間的重組。因?yàn)橹亟M酶（如地iC31整合酶）不能單獨(dú)催化逆反應(yīng)，phiC31 attBXattP重組是穩(wěn)定的。
[0137] 在本領(lǐng)域中描述了不可逆重組酶及編碼不可逆重組酶的核酸，并且可使用慣用 方法獲得不可逆重組酶及編碼不可逆重組酶的核酸。不可逆重組酶的實(shí)例包括但不限于 地iC31 (蛛€31)'重組酶（SEQIDNO:11)、大腸桿菌隧菌體P4重組酶巧9]、大腸桿菌隧菌體 入整合酶[40]、利斯特菌屬A118隧菌體重組酶[41]、放線菌隧菌體R4Sre重組酶[42]、 HK101、HK022、pSAM2、Bxbl、TP901、TGl、q)BTl.、（pRVl、（pFCKMR1UU153 及甜29。
[013引相反，"可逆重組酶"是指運(yùn)樣的酶，其可催化兩個(gè)互補(bǔ)的重組酶識(shí)別位點(diǎn)之間的 重組并且在沒有附加因素輔助的情況下能夠催化由最初重組事件形成的位點(diǎn)之間的重組 從而逆轉(zhuǎn)最初重組事件。由重組產(chǎn)生的產(chǎn)物位點(diǎn)本身是后續(xù)重組的底物?？赡嬷亟M酶系統(tǒng) 的實(shí)例包括但不限于Cre-Iox和Flp-frt系統(tǒng)、R、06、CinH、ParAW及丫5。
[0139] 本文所提供的重組酶不意味著可在本發(fā)明的實(shí)施方案中使用的重組酶的實(shí)例是 排他性的。本發(fā)明的邏輯與存儲(chǔ)系統(tǒng)的復(fù)雜性可通過(guò)挖掘新的正交重組酶的數(shù)據(jù)庫(kù)或者設(shè) 計(jì)具有確定DNA特異性的合成重組酶而擴(kuò)展巧0, 21]。在本文所描述的合成邏輯與存儲(chǔ)系 統(tǒng)中可用的重組酶的其他實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，并且預(yù)期發(fā)現(xiàn)或產(chǎn)生的任何新 的重組酶能夠在本發(fā)明的不同實(shí)施方案中使用。
[0140] 在一些實(shí)施方案中，重組酶是絲氨酸重組酶。因此，在一些實(shí)施方案中，重組酶被 認(rèn)為是不可逆的。在一些實(shí)施方案中，重組酶是酪氨酸重組酶。因此，在一些實(shí)施方案中， 重組酶被認(rèn)為是可逆的。
[014。在一些實(shí)施方案中，重組酶包含如在沈QIDNO:8(表2)所列出的Bxbl重組酶 的序列W及如在SEQIDNO:9和SEQIDNO: 10中分別所列出的相應(yīng)的BxblattB和Bxbl attP重組酶識(shí)別序列。
[0142] 在一些實(shí)施方案中，重組酶包含如在SEQIDNO:11 (表2)所列出的 地iC31 ((pOl)重組酶的序列W及如在沈QIDN0:12和沈QIDN0:13中分別所列出的 相應(yīng)的地iC31attB和地iC31attP重組酶識(shí)別序列。
[0143] 啟動(dòng)子
[0144] 本文提供了在本發(fā)明的基于重組酶的合成邏輯與存儲(chǔ)系統(tǒng)中使用的啟動(dòng)子序列 ("啟動(dòng)子"）。如本文中所使用的，"啟動(dòng)子"指的是核酸序列的控制區(qū)域，在此起始并控制 核酸序列的剩余部分的轉(zhuǎn)錄速率。啟動(dòng)子還可W包含亞區(qū)，在亞區(qū)中，可W結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白和 分子，如RNA聚合酶及其他轉(zhuǎn)錄因子。啟動(dòng)子可W是組成型的、誘導(dǎo)型的、可激活的、可阻遏 的、組織特異性的或其任何組合。
[0145]啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)其調(diào)節(jié)的核酸序列的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄。如本文中所使用的，"有效連接"和 "在控制下"表明啟動(dòng)子相對(duì)于其調(diào)節(jié)的核酸序列處在正確的功能性位置和/或方向W控制 該序列的轉(zhuǎn)錄起始和/或表達(dá)。如上所述的"反向啟動(dòng)子"是其中核酸序列處在反向方向 使得曾經(jīng)的編碼鏈現(xiàn)在變成非編碼鏈而曾經(jīng)的非編碼鏈現(xiàn)在是編碼鏈的啟動(dòng)子。在本發(fā)明 的多種實(shí)施方案中可W使用反向啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)邏輯口的狀態(tài)（例如，高輸出"0N"，或低/無(wú) 輸出"OFF")。因此，在一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是側(cè)翼有互補(bǔ)的重組酶識(shí)別位點(diǎn)的反向啟 動(dòng)子，該反向啟動(dòng)子在位點(diǎn)重組后，反向到正確的方向并驅(qū)動(dòng)有效連接的核酸序列的表達(dá)。 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子可W或可W不聯(lián)合"增強(qiáng)子"一起使用，增強(qiáng)子指的是 參與啟動(dòng)子下游核酸序列的轉(zhuǎn)錄激活的順式作用調(diào)節(jié)序列。增強(qiáng)子可W位于在啟動(dòng)子和/ 或編碼核酸之前或之后的任何功能性位置處。
[0146] 根據(jù)其對(duì)于RNA聚合酶（和/或O因子）的親和力，啟動(dòng)子被分類為強(qiáng)或弱，運(yùn) 牽設(shè)到啟動(dòng)子序列與聚合酶的理想共有序列類似的密切程度。啟動(dòng)子的強(qiáng)度可W取決于轉(zhuǎn) 錄起始在該啟動(dòng)子W高頻率還是低頻率發(fā)生。具有不同強(qiáng)度的不同啟動(dòng)子可W用于構(gòu)造具 有基因輸出表達(dá)的不同的數(shù)字可設(shè)置水平的邏輯口（例如，從弱啟動(dòng)子起始的基因表達(dá)的 水平低于從強(qiáng)啟動(dòng)子起始的基因表達(dá)的水平）。例如，圖26A至26C中所示出的數(shù)據(jù)證明輸 入誘導(dǎo)物的多種數(shù)字組合導(dǎo)致多種水平的模擬基因表達(dá)輸出，所述輸出取決于所使用的啟 動(dòng)子的不同強(qiáng)度W及它們各自輸出的總和。
[0147] 啟動(dòng)子可W是與基因或序列自然相關(guān)的啟動(dòng)子，如可W通過(guò)分離位于給定基因或 序列之編碼區(qū)段和/或外顯子之上游的5'非編碼序列獲得。運(yùn)樣的啟動(dòng)子可W被稱為"內(nèi) 源性的"。類似地，增強(qiáng)子可W與核酸序列自然相關(guān)、位于該序列的上游或下游。
[014引在一些實(shí)施方案中，可W將編碼核酸區(qū)段定位成在重組啟動(dòng)子或異源啟動(dòng)子的控 制下，所述重組啟動(dòng)子或異源啟動(dòng)子指的是在其自然環(huán)境中通常不與編碼核酸序列自然相 關(guān)的啟動(dòng)子。重組增強(qiáng)子或異源增強(qiáng)子指的是在其自然環(huán)境中通常不與核酸序列相關(guān)的 增強(qiáng)子。運(yùn)樣的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可W包括其他基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，從任何其他的原核 細(xì)胞、病毒或真核細(xì)胞分離的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，W及非"自然存在"的合成啟動(dòng)子或增強(qiáng)子， 例如，包含通過(guò)本領(lǐng)域已知的基因工程方法改變表達(dá)之突變和/或不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的不 同元件的那些。除了W合成方法產(chǎn)生啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的核酸序列，還可W使用重組克隆和 /或核酸擴(kuò)增技術(shù)（包括PCR)來(lái)生成與本文所公開的邏輯口連接的序列（參見美國(guó)專利 No. 4, 683, 202和美國(guó)專利No. 5, 928, 906)。此外，根據(jù)本發(fā)明可W使用指導(dǎo)無(wú)核細(xì)胞器（如 線粒體、葉綠體等）內(nèi)的序列之轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的控制序列。
[0149] 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子