2]作為在此使用的作為對(duì)象的抗癌劑，與前述同樣，例如，可以舉出奧沙利鉑、環(huán)磷 酰胺（cyclophosphamide)、異磷酰胺（ifosf amide)、噻替哌（thiotepa)、美法侖 (melphalan)、白消安(busulfan)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、達(dá)卡巴 嗪（dacarbazine)、丙卡巴餅（procarbazine)、替莫唑胺（temozolomide)、順鉬 (cisplatin)、卡鉬（carboplatin)、奈達(dá)鉬（nedaplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美 曲塞(pemetrexed)、氟尿啼啶(f luorouracil)、替加氟/尿啼啶（tegaful/uracil)、脫氧氟 尿苷((1(?1；1^1111^(1；[116)、替加氟/吉美拉西/奧替拉西(^683；1^11/^；[1116瓜(3；[1/(^6抑(3；[1)、卡培 他濱（capeci tabine)、阿糖胞苷（cytarabine)、依諾他濱（enoci tabine)、吉西他濱 (區(qū)6111(3；!^&13；[116)、6-疏基噪呤（61161^&。1：(^111'；[116)、氣達(dá)拉濱（；1^11111(1&1&13；[11)、噴司他汀 (pentostatin)、克拉屈濱(cladribine)、羥基脈(hydroxyurea)、多柔比星(doxorubicin)、 表柔比星（epirubicin)、佐柔比星（daunorubicin)、依達(dá)比星（idarubicine)、吡柔比星 (卩；[以1'1113；[(3；[11)、米托蒽醌（111；[1：013111：1'0116)、氨柔比星（3111111'1113；[(3；[11)、放線菌素0 (act inomycin D)、博來(lái)霉素（bl eomycine )、派來(lái)霉素（pepl eomycin)、絲裂霉素C (mytomycin C)、阿柔比星（aclarubicin)、凈司他?。▃inostatin)、長(zhǎng)春新堿 (vincristine)、長(zhǎng)春地辛（vindesine)、長(zhǎng)春喊（vinblastine)、長(zhǎng)春瑞濱（vinorelbine)、 紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、伊立替康（irinotecan)、伊立替康活性代 謝物（SN-38)、托泊替康（1108；^60311，1：(^0丨60311)、依托泊苷（61：(^081(16)、潑尼松龍 (prednisolone)、地塞米松（dex am ethasone)、他莫昔芬（tamoxifen)、托瑞米芬 (toremifene)、甲輕孕酮（medroxyprogesterone)、阿那曲挫（anastrozole)、依西美坦 (exemestane)、來(lái)曲唑（letrozole)、利妥昔(rituximab)、伊馬替尼（imatinib)、吉非替尼 (gefitinib)、吉姆單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、硼替佐米(bortezomib)、厄洛 替尼（erlotinib)、西妥昔單抗（cetuximab)、貝伐單抗（bevac izumab )、舒尼替尼 (sunitinib)、索拉非尼（sorafenib)、達(dá)沙替尼（dasatinib)、帕尼單抗(panitumumab)、門(mén) 冬酰胺酶(asparaginase)、維甲酸（tretinoin)、三氧化二砷(arsenic trioxide)、或它們 的鹽、或它們的活性代謝物等。其中，優(yōu)選氟化嘧啶類(lèi)抗癌劑、鉑配位化合物類(lèi)抗癌劑，特別 優(yōu)選氟尿嘧啶、奧沙利鉑或者它們的鹽。進(jìn)而，在氟尿嘧啶或其鹽、奧沙利鉑或其鹽的并用 劑中能夠適宜地利用。
[0103] 實(shí)施例
[0104] 接著，舉出實(shí)施例，更詳細(xì)的說(shuō)明本發(fā)明。
[0105] 實(shí)施例1
[0106] (1)方法
[0107] (a)使用細(xì)胞
[0108] 2種人大腸癌細(xì)胞株(HCT-116、DLD-1)從ECACC獲得。培養(yǎng)在以下條件下進(jìn)行，即， C>100mm/Tissue Culture Dish(IWAKI)，培養(yǎng)基（D_MEM，2mM Glutamine，10%Fetal Bovine Serum)，37°C，5%0〇2。（13)藥劑
[0109 ]氟尿嘧啶(5-FU)從Si gma公司購(gòu)入，奧沙利鉑(L-OHP)散裝粉末從株式會(huì)社益力多 本社獲得。
[0110] (c) 5-FU、L-OHP 以及 5-FU和 L-OHP并用（5-FU/L-OHP)時(shí)的感受性評(píng)價(jià)
[0111] 使用2種大腸癌細(xì)胞株HCT116、DLD-1，通過(guò)MTS assay(CellTiter96?AQu_s One Solution Cell Proliferation Assay，Promega)評(píng)價(jià)在藥劑暴露24小時(shí)后和48小時(shí)后的 細(xì)胞生存率。藥劑暴露條件為，作為5-FU單劑，使用對(duì)照(Control)(0yM)、0.001yM、0.01yM、 0 · ΙμΜ、1μΜ、3μΜ、10μΜ、30μΜ、100μΜ、1000μΜ、10000μΜ這 11 個(gè)條件;作為L(zhǎng)-OHP單劑，使用對(duì)照 (Control)(ΟμΜ)、0·001μΜ、0·01μΜ、0·1μΜ、0·3μΜ、1μΜ、3μΜ、10μΜ、30μΜ、100μΜ、1000μΜ這11 個(gè)條件。作為并用，使用分別向5-FU的2μΜ、1 ΟμΜ、30μΜ、100μΜ這4個(gè)濃度，加入L-OHP的0.01μ Μ、0.1μΜ、0.3μΜ、1μΜ、3μΜ、10μΜ、30μΜ、100μΜ、1000μΜ的9個(gè)濃度的36個(gè)條件，以及與各并用 條件相同濃度的5-FU單劑4個(gè)條件和對(duì)照(Control)(0yM)。在感受性評(píng)價(jià)中，在1次試驗(yàn)中， 對(duì)各個(gè)細(xì)胞株、藥劑暴露時(shí)間、藥劑暴露條件，每次進(jìn)行3個(gè)樣品的測(cè)定，用不同培養(yǎng)代數(shù)的 細(xì)胞實(shí)施3次。
[0112]以根據(jù)MTS assay的結(jié)果計(jì)算出的生存率為基礎(chǔ)進(jìn)行分析。在判定有無(wú)并用效果 時(shí)，比較并用時(shí)的生存率(viability)和與并用時(shí)使用的相同濃度的各藥劑在單劑暴露時(shí) 的生存率，如果與雙方相比生存率有意義地下降，則判定具有并用效果。
[0113] (d)藥劑暴露實(shí)驗(yàn)
[0114]基于上述(c)的結(jié)果，在暴露實(shí)驗(yàn)中使用的藥劑濃度，作為5-FU+L-OHP的并用，為2 μΜ+1μΜ、2μΜ+10μΜ、100μΜ+1μΜ、100μΜ+10μΜ這4種，作為與這些并用暴露時(shí)使用的相同濃度 的各藥劑單獨(dú)暴露，5-FU為2μΜ、100μΜ，?-0ΗΡ為1μΜ、10μΜ，加上這些中沒(méi)有藥劑的對(duì)照 (Control)全部9個(gè)條件，進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)。藥劑暴露時(shí)間為暴露前(0小時(shí)）、4小時(shí)、12小時(shí)、24 小時(shí)、48小時(shí)5種，在暴露結(jié)束的時(shí)刻計(jì)測(cè)細(xì)胞數(shù)，提取細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。
[0115] (e)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的提取
[0116] 從培養(yǎng)皿(dish)除去培養(yǎng)基，用冰冷的PBS中清洗3次，之后，以橡膠刮子剝離收 集，將細(xì)胞懸液移到1.5mL的微量離心管中。在4°C以1200 X g離心10分鐘，收集細(xì)胞，除去上 清液之后，每1000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞數(shù)加入200yL的細(xì)胞溶解緩沖液(9mol/L Urea，2 % CHAPS，ImM DTT，蛋白酶抑制劑（Sigma))，在冰冷下進(jìn)行超聲波破碎處理，之后，在4°C以16000 X g離心 分離20分鐘，在液氮中急速凍結(jié)上清液，在分析前保存在-80°C。使用上清液的一部分進(jìn)行 蛋白質(zhì)定量(DC Protein Assay Kit，Bio_Rad)〇
[0117] (f)用于蛋白質(zhì)表達(dá)分析的樣品制備和蛋白質(zhì)芯片的制作、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá) 分析
[0118] 用細(xì)胞溶解緩沖液(除去蛋白酶抑制劑）制備為2.5mg/mL，接著，以pH4.5的稀釋/ 清洗緩沖液（50mM sodium acetate buffer)(以下，稱(chēng)為緩沖液）制備為0.5mg/mL，將該樣 品100yL供給以同樣的緩沖液進(jìn)行過(guò)前處理的陽(yáng)離子交換芯片陣列（CM10，Bi〇-Rad)的點(diǎn)， 孵育1小時(shí)進(jìn)行反應(yīng)后，以緩沖液清洗3次，以mi 11 iQ水沖洗2次。風(fēng)干后，將1. OyL能量吸收 分子（energy absorbing molecule，EAM: 50%ACN/0 · 5%TFA溶液的芥子酸（sinapinic acid)飽和溶液）以每次0.5yL分2次供給到各點(diǎn)，點(diǎn)表面干燥后，進(jìn)行蛋白質(zhì)芯片陣列的分 析。
[0119] 蛋白質(zhì)表達(dá)分析通過(guò)表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間型質(zhì)量分析儀（surface-enhanced laser desorption/ionization time-〇f-flight mass spectrometry：SELDI-T0F MS)進(jìn)行。作為分析儀器，使用ProteinChip? Reader(Model PCS4000Personal Edition，Bio-Rad)，在MassRange0~70000Daltons、FocusMass 8000Dalton、Energy 3000或4000nJ、每一個(gè)樣品合計(jì)265shots的條件下進(jìn)行分析。Signal-to-noise ratio(S/N 比）2以上的峰的提取和蛋白質(zhì)表達(dá)比較分析使用CiphergenExpress? Data Manager 3.0 進(jìn)行。
[0120] (g)候補(bǔ)峰的選擇
[0121] 通過(guò)SELDI-T0F MS分析的結(jié)果，在S/N比2以上的條件下各樣品提取88~143個(gè)蛋 白質(zhì)峰。首先，通過(guò)CiphergenExpress? Data Manager 3.0做成峰簇。接著，挑選在各條件 下，藥劑暴露后隨著時(shí)間而峰強(qiáng)度有意義地變化的峰、和各暴露時(shí)間（4、12、24、48小時(shí)）下 隨著藥劑暴露條件而峰強(qiáng)度有意義地變化的峰。找出兩者都可檢測(cè)出的峰，即，確認(rèn)了既隨 著暴露時(shí)間而表達(dá)變化也隨著藥劑條件而表達(dá)變化的峰。
[0122] (2)結(jié)果
[0123] (a)HCT_116和DLD-1的藥劑感受性的評(píng)價(jià)
[0124] 以100μΜ的5-FU暴露48小時(shí)后的細(xì)胞生存率，HCT116為約24%，DLD-1為約49%，確 認(rèn)DLD-1與HCT116相比為5-FU低感受性。以ΙμΜ的L-OHP暴露48小時(shí)后的細(xì)胞生存率，HCT116 為約37%，DLD-1為約82%，確認(rèn)DLD-1與HCT116相比為L(zhǎng)-OHP低感受性。對(duì)于5-FU/L-OHP并 用而言，5-FU 2yM+L-OHP ΙμΜ暴露24小時(shí)后，以及5-FU100yM+L-OHP ΙΟμΜ暴露48小時(shí)后，在 HCT116中，與各個(gè)單劑暴露后的細(xì)胞生存率相比，在并用時(shí)顯示為有意義的低細(xì)胞生存率， 確認(rèn)了并用效果，但在DLD-1中沒(méi)有確認(rèn)有意義的并用效果。因此，確認(rèn)HCT116對(duì)于5-FU/L-0ΗΡ并用為高感受性細(xì)胞，DLD-1為低感受性細(xì)胞(圖1)
[0125] (b)蛋白質(zhì)表達(dá)分析
[0126] 通過(guò)使用SELDI-TOF MS的蛋白質(zhì)組分析方法，網(wǎng)羅式分析5-FU暴露、或者L-OHP暴 露、或者5-FU/L-OHP并用暴露所伴隨的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變動(dòng)。利用（1)方法所示的方法進(jìn)行 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各藥劑暴露后顯示特征變動(dòng)的以下蛋白質(zhì)。
[0127] (5-FU)
[0128] 對(duì)5-FU暴露后的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的經(jīng)時(shí)變化進(jìn)行分析的結(jié)果，（1 )5_FU暴露后的細(xì) 胞內(nèi)水平，只在DLD-1中上升，或者與HCT116比較，在DLD-1中觀察到更大上升的峰（圖2、圖 3、圖4(甲）、圖7(甲）、圖9、圖10、圖11(甲）、圖12)
[0129] ·πι/ζ 5300~5400(蛋白質(zhì)A)
[0130] ·πι/ζ 6130~6230(蛋白質(zhì)B)
[0131] ·πι/ζ 7000~7080(蛋白質(zhì)C)
[0132] ·πι/ζ 11020 ~11120(蛋白質(zhì) F)
[0133] ·πι/ζ 17100 ~17270(蛋白質(zhì) H)
[0134] ·πι/ζ 18290 ~18470(蛋白質(zhì) I)
[0135] ·πι/ζ 24660~24750(蛋白質(zhì)J)
[0136] ·πι/ζ 35980~36290(蛋白質(zhì)K)
[0137] (2)5-FU暴露后，在HCT116觀察到細(xì)胞內(nèi)水平降低的峰(圖5(丙）、圖14)
[0138] ·πι/ζ 7840~7920(蛋白質(zhì)D)
[0139] ·πι/ζ 9100~9200(蛋白質(zhì)M)
[0140] (L-OHP)
[0141 ]對(duì)L-OHP暴露后的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的經(jīng)時(shí)變化進(jìn)行分析的結(jié)果，
[0142] (1 )L-〇HP暴露后的細(xì)胞內(nèi)水平，只在DLD-1中上升，或者與HCT116比較，在DLD-1中 觀察到更大上升的峰（圖2、圖3、圖4(乙）、圖7(乙）、圖8(甲）、圖9、圖10、圖11(丙）、圖12)
[0143] ·πι/ζ 5300~5400(蛋白質(zhì)A)
[0144] ·πι/ζ 6130~6230(蛋白質(zhì)B)
[0145] ·πι/ζ 7000~7080(蛋白質(zhì)C)
[0146] ·πι/ζ 11020 ~11120(蛋白質(zhì) F)
[0147] ·πι/ζ 12440 ~12560(蛋白質(zhì) G)
[0148] ·πι/ζ 17100 ~17270(蛋白質(zhì) H)
[0149] ·πι/ζ 18290 ~18470(蛋白質(zhì) I)
[0150] ·πι/ζ 24660~24750(蛋白質(zhì)J)
[0151] ·πι/ζ 35980~36290(蛋白質(zhì)K)
[0152] (2)L-OHP暴露后，在HCT116中觀察到細(xì)胞內(nèi)水平降低的峰（圖5(甲）、圖14)