[0153] ·πι/ζ 7840~7920(蛋白質(zhì)D)
[0154] ·πι/ζ 9100~9200(蛋白質(zhì)M)
[0155] (5-FU/L-OHP)
[0156] 對(duì)5-FU/L-OHP并用暴露后的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的經(jīng)時(shí)變化進(jìn)行分析的結(jié)果，
[0157] (1) 5-FU/L-OHP暴露后的細(xì)胞內(nèi)水平，只在DLD-1中上升，或者與HCT116比較，在 DLD-1中觀察到更大上升的峰（圖2、圖3、圖4(丙）、圖7(丙）、圖9、圖10、圖11(乙）、圖12)。
[0158] · m/z 5300~5400(蛋白質(zhì)A)
[0159] · m/z 6130~6230(蛋白質(zhì)B)
[0160] · m/z 7000~7080(蛋白質(zhì)C)
[0161] · m/z 11020~11120(蛋白質(zhì)F)
[0162] · m/z 17100~17270(蛋白質(zhì)H)
[0163] .m/z 18290 ~18470(蛋白質(zhì) I)
[0164] · m/z 24660~24750(蛋白質(zhì)J)
[0165] · m/z 35980~36290(蛋白質(zhì)K)
[0166] (2) 5-FU/L-OHP并用暴露后，在HCT116中觀察到細(xì)胞內(nèi)水平上升的峰（圖6、圖8 (乙)）
[0167] · m/z 8920~9000(蛋白質(zhì)E)
[0168] · m/z 12440~12560(蛋白質(zhì)G)
[0169] (3) 5-FU/L-OHP并用暴露后，在HCT116中觀察到細(xì)胞內(nèi)水平降低的峰（圖5 (乙）、圖 14)
[0170] · m/z 7840~7920(蛋白質(zhì)D)
[0171] · m/z 9100~9200(蛋白質(zhì)M)
[0172](藥劑暴露前的細(xì)胞內(nèi)水平）
[0173]藥劑暴露前(非暴露時(shí)）的細(xì)胞內(nèi)水平，與DLD-1比較，在HCT116中顯示有意義的高 值的峰
[0174] · m/z 6130~6230(蛋白質(zhì)B)
[0175] · m/z 8650~8750(蛋白質(zhì)L)
[0176] · m/z 11760~11890(蛋白質(zhì)N)
[0177] · m/z 17100~17270(蛋白質(zhì)H)
[0178]蛋白質(zhì)B中的藥劑暴露前的細(xì)胞內(nèi)水平，作為通過(guò)SELDI-T0FMS分析得到的峰強(qiáng)度 (μΑ)(平均值土S.D.，n = 27)，在HCT116中為55.4±9.2，在0〇)-1中為28.9±6.4，同樣，蛋白 質(zhì) L 在HCT116 中為 88.2±2.2,在 DLD-1 中為 32.1±1.3，蛋白質(zhì)~在!1(：1'116中為85.1±9.3，在 DLD-1 中為 50.6±6.0，蛋白質(zhì)!1在!1(：1'116中為15.5±2.1，在00)-1中為3.86±1.34，上述任 一個(gè)蛋白在HCT116中的藥劑暴露前(非暴露時(shí))細(xì)胞內(nèi)水平均顯示比DLD-1有意義的高值。
[0179] 實(shí)施例2
[0180] 對(duì)于在實(shí)施例1中發(fā)現(xiàn)的全部的峰，作為分子量已知的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用insulin oxidized B chain(bovine)(m/z 3496·94+1H)、Insulin(bovine)(m/z 5733.51+1H)、 Cytochrome c(equine)(m/z 12360.96+lH)、Apomyoglobin(equine)(m/z 16952.27+1H)、 Aldorase(reabbit muscle) (m/z 39212.28+1H)，使用夾持各目的峰的2種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分子 量2點(diǎn)的分子量補(bǔ)正（internal calibration)進(jìn)行m/z確認(rèn)。其結(jié)果，實(shí)施例1中發(fā)現(xiàn)的峰分 別確認(rèn)是在m/z 5300~5400(蛋白質(zhì)A)、m/z6130~6230(蛋白質(zhì)B)、m/z 7000~7080(蛋白 質(zhì)C)、m/z 7840~7920(蛋白質(zhì)D)、m/z 8920~9000(蛋白質(zhì)E)、m/z 11020~11120(蛋白質(zhì) F)、m/z 12440 ~12560(蛋白質(zhì) G)、m/z 17100 ~17270(蛋白質(zhì) H)、m/z 18290 ~18470(蛋白 質(zhì)I)、m/z 24660~24750(蛋白質(zhì)J)、m/z35980~36290(蛋白質(zhì)K)、m/z 8650~8750(蛋白質(zhì) L)、m/z 9100~9200(蛋白質(zhì)M)、m/z 11760~11890(蛋白質(zhì)N)之間檢測(cè)出的。
[0181] 實(shí)施例3
[0182] 對(duì)于在實(shí)施例1發(fā)現(xiàn)的全部峰，為了更詳細(xì)的研究其性質(zhì)，對(duì)隨著pH變化的峰強(qiáng)度 變化進(jìn)行了研究。
[0183] (1)方法
[0184] (a)研究所使用的蛋白質(zhì)芯片陣列和緩沖液條件
[0185] 對(duì)于陽(yáng)離子交換芯片陣列（CM10，Bi〇-Rad)，使用 pH3.0(50mM Glycine-HCL buffer)、pH3·5(50mM sodium acetate buffer)、pH4.0(50mM sodium acetate buffer)、 pH4.5(50mM sodium acetate buffer)、pH5·0(50mM sodium acetate buffer)、pH5·5 (50mM sodium acetate buffer)、pH6.0(50mM phosphate buffer)、pH6.5(50mM phosphate buffer)pH7.0(50mM phosphate buffer)、pH7·5(50mM phosphate buffer)、 pH8.0(50mM Tris-HCL buffer)^pH8.5(50mM Tris-HCL buffer)^pH9.0(50mM Glycine-NaOH buffer)、pH9.5(50mM Glycine-NaOH buffer)、pH10.0(50mM Glycine-NaOH buffer) 的15種緩沖液。
[0186] (b)用于使用CM10芯片陣列進(jìn)行分析的樣品制備和蛋白質(zhì)芯片的制作和分析條件
[0187] 用于使用CM10芯片陣列的分析的樣品制備和蛋白質(zhì)芯片的制作，使用(a)的各緩 沖液，按照實(shí)施例1的（1)方法的上述(f)為基準(zhǔn)實(shí)施。
[0188] ⑵結(jié)果
[0189] 使用CM10芯片陣列的分析中，能夠判斷觀察到峰強(qiáng)度降低的pH在該蛋白質(zhì)的離子 化喪失的等電點(diǎn)(Pi)附近。其結(jié)果，在實(shí)施例1檢測(cè)出的峰的等電點(diǎn)(Pi)推定：
[0190] · m/z 7000~7080(蛋白質(zhì)C)pH3.5~6.5
[0191] · m/z 8920~9000(蛋白質(zhì)Ε)ρΗ4·0~7.0
[0192] · m/z 11020~11120(蛋白質(zhì)F)pH7.0~8.0
[0193] · m/z 12440~12560(蛋白質(zhì)G)pH4.5~7.5
[0194] · m/z 17100~17270的（蛋白質(zhì)Η)ρΗ5·0~8.0
[0195] · m/z 18290~18470(蛋白質(zhì)Ι)ρΗ6·5~9.5
[0196] · m/z 24660~24750(蛋白質(zhì)J)pH3.5~6.5
[0197] · m/z 35980~36290(蛋白質(zhì)Κ)ρΗ3·0~6.5
[0198] · m/z 8650~8750(蛋白質(zhì)L)pH4.5~7.0
[0199] · m/z 9100~9200(蛋白質(zhì)Μ)ρΗ4·5~7.5
[0200] · m/z 11760~11890(蛋白質(zhì)Ν)ρΗ4·5~7.5
[0201]相當(dāng)于pi附近。m/z 5300~5400(蛋白質(zhì)A)、m/z 6130~6230(蛋白質(zhì)B)、m/z 7840 ~7920 (蛋白質(zhì)D)的峰強(qiáng)度降低，pH不明確。
[0202] 實(shí)施例4
[0203]對(duì)于在實(shí)施例1中發(fā)現(xiàn)的峰，基于實(shí)施例2和實(shí)施例3的信息，使用The ExPASy proteomics server的TagIdent tool(http://au.expasy.org/tools/tagident.html)? 行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。其結(jié)果如下所示。











[0228]數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的結(jié)果，m/z 11020~11120(蛋白質(zhì)F)只檢索到一種蛋白質(zhì)（Protein S100-A10)。蛋白質(zhì)F(鈣結(jié)合蛋白質(zhì)S100A10)能夠作為L(zhǎng)-OHP的抗癌劑感受性判定標(biāo)記利 用，在本發(fā)明的發(fā)明人的在先申請(qǐng)(W02009/96196號(hào)國(guó)際公開(kāi)小冊(cè)子）中已經(jīng)闡明，通過(guò)這 次的實(shí)施例，確認(rèn)了其不僅是L-OHP感受性的治療前預(yù)測(cè)的標(biāo)記，還可以成為治療開(kāi)始后早 期判定治療反應(yīng)性的標(biāo)記，此外，還可作為在5-FU單劑或5-FU和L-OHP并用時(shí)能夠使用的標(biāo) 記。
[0229] 實(shí)施例5
[0230] 實(shí)施例4的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的結(jié)果，m/z 11020~11120(蛋白質(zhì)F)只檢索到一種蛋白質(zhì) (Protein S100-A10)，由此，確認(rèn)其在HCT116和DLD-1 中表達(dá)。
[0231] (1)方法
[0232] 對(duì)于HCT116和DLD-1，通過(guò)與實(shí)施例1同樣的方法，提取細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，之后通過(guò) 100V定電壓進(jìn)行SDS-PAGE。電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印在PVDF膜上，進(jìn)行封閉后，使用抗S100A10 單克隆抗體（Purified Mouse Anti-Annexin II light chain monoclonal antibody,BD Transduction Laboratories)進(jìn)行一次抗體反應(yīng)。在與堿性磷酸酶標(biāo)記抗小鼠IgG抗體進(jìn) 行二次抗體反應(yīng)后，添加作為反應(yīng)底物的⑶P-Star? chemiluminescent substrate使其發(fā) 光，通過(guò)發(fā)光圖像分析儀(LAS-4000mini，F(xiàn)UJIFILM)檢測(cè)。
[0233] ⑵結(jié)果
[0234] 實(shí)施例1中，m/z 11020~11120(蛋白質(zhì)F)的HCT116和DLD-1中S100A10的表達(dá)，通 過(guò)使用抗S100A10單克隆抗體的蛋白質(zhì)印跡法得到確認(rèn)(圖13)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗癌劑的感受性判定標(biāo)記，其特征在于： 其包含鈣結(jié)合蛋白質(zhì)S100A10， 所述抗癌劑包含氟尿嘧啶或其鹽、或者氟尿嘧啶或其鹽和奧沙利鉑或其鹽的組合。2. 如權(quán)利要求1所述的感受性判定標(biāo)記，其特征在于： 所述抗癌劑是氟尿嘧啶或其鹽和奧沙利鉑或其鹽的組合， 作為抗癌劑感受性判定對(duì)象的癌是大腸癌。3. -種抗癌劑感受性的判定方法，其特征在于： 測(cè)定檢測(cè)體中的權(quán)利要求1所述的鈣結(jié)合蛋白質(zhì)S100A10。4. 如權(quán)利要求3所述的判定方法，其特征在于： 檢測(cè)體是來(lái)自患有癌的被檢驗(yàn)者機(jī)體的試樣。5. 如權(quán)利要求3或4所述的判定方法，其特征在于： 檢測(cè)體是來(lái)自被投與了抗癌劑的患有癌的被檢驗(yàn)者機(jī)體的試樣。6. -種試劑盒，用于實(shí)施權(quán)利要求3或4所述的判定方法，所述試劑盒的特征在于： 包含用于測(cè)定檢測(cè)體中的權(quán)利要求1所述的鈣結(jié)合蛋白質(zhì)S100A10的方案。7. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于： 檢測(cè)體是來(lái)自患有癌的被檢驗(yàn)者機(jī)體的試樣。8. 如權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于： 檢測(cè)體是來(lái)自被投與了抗癌劑的患有癌的被檢驗(yàn)者機(jī)體的試樣。9. 一種抗癌劑感受性增強(qiáng)劑的篩選方法，其特征在于： 以權(quán)利要求1所述的鈣結(jié)合蛋白質(zhì)S100A10的表達(dá)改變作為指標(biāo)。10. 如權(quán)利要求9所述的抗癌劑感受性增強(qiáng)劑的篩選方法，其特征在于： 所述抗癌劑是氟尿嘧啶或其鹽和奧沙利鉑或其鹽的組合， 作為抗癌劑感受性判定對(duì)象的癌是大腸癌。11. 一種由權(quán)利要求9或10所述的方法得到的抗癌劑感受性增強(qiáng)劑。12. -種癌治療用組合物，其特征在于： 含有權(quán)利要求11所述的抗癌劑感受性增強(qiáng)劑和作為感受性增強(qiáng)對(duì)象的抗癌劑的組合。13. 媽結(jié)合蛋白質(zhì)S100A10作為抗癌劑的感受性判定標(biāo)記在用于判定抗癌劑感受性的 試劑盒的制造中的用途，其特征在于： 所述試劑盒包含用于測(cè)定檢測(cè)體中的鈣結(jié)合蛋白質(zhì)S100A10的方案， 所述抗癌劑包含氟尿嘧啶或其鹽、或者氟尿嘧啶或其鹽和奧沙利鉑或其鹽的組合。14. 如權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于： 所述抗癌劑是氟尿嘧啶或其鹽和奧沙利鉑或其鹽的組合， 作為抗癌劑感受性判定對(duì)象的癌是大腸癌。15. 如權(quán)利要求14所述的用途，其特征在于： 檢測(cè)體是來(lái)自患有癌的被檢驗(yàn)者機(jī)體的試樣。16. 如權(quán)利要求14或15所述的用途，其特征在于： 檢測(cè)體是來(lái)自被投與了抗癌劑的患有癌的被檢驗(yàn)者機(jī)體的試樣。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種能夠判別各個(gè)患者的治療反應(yīng)的抗癌劑感受性判定標(biāo)記和利用其的新的癌癥治療方法。一種抗癌劑感受性判定標(biāo)記，其包含鈣結(jié)合蛋白質(zhì)S100A10，所述抗癌劑包含氟尿嘧啶或其鹽、或者氟尿嘧啶或其鹽和奧沙利鉑或其鹽的組合。
【IPC分類(lèi)】A61P35/00, G01N33/50, A61K45/06
【公開(kāi)號(hào)】CN105699638
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610094199
【發(fā)明人】谷川原祐介, 鈴木小夜, 生駒祐介, 西牟田章戶, 鈴木哲也, 杉本伸二
【申請(qǐng)人】學(xué)校法人慶應(yīng)義塾, 株式會(huì)社益力多本社
【公開(kāi)日】2016年6月22日
【申請(qǐng)日】2010年10月29日
【公告號(hào)】CN102597779A, CN102597779B, EP2495569A1, EP2495569A4, EP2495569B1, US8765713, US20120214831, WO2011052749A1