進入到所述的針孔中，將上述模具放于干燥器中，4°C條件下晾干；
[0047] (3)將低分子量的硫酸乙酰肝素按照50重量％溶解到水中，作為基質(zhì)材料制作 液，然后將〇.〇2克該基質(zhì)材料制作液倒入步驟（2)干燥后得到的負載有臺盤蘭、VR-S2S與 海藻糖的塌陷出的針孔中，置于密閉容器中，在模具上方施加2個大氣壓，維持10分鐘，使 所述的針孔中殘存的空氣溢出；然后將覆蓋有基質(zhì)材料制作液的模具于干燥器中4°C條件 下晾干，將干燥后的自溶性微針疫苗貼片取下，得到含有低分子量硫酸乙酰肝素的自溶性 微針疫苗透皮貼片（如圖2所示），自溶性微針針體的高度是500微米，針尖的角度是30 度，針尖直徑是5微米；其中臺盤蘭基本分布在每一根微針的針體部分，背襯層基本不含有 臺盤蘭。所得的自溶性微針疫苗貼片中含疫苗10微克，疫苗保護劑（海藻糖）2毫克，微針 基質(zhì)材料（寡聚透明質(zhì)酸）10毫克。
[0048] 本實施例中選用的低分子量的硫酸乙酰肝素的重均分子量為4000,由山東福瑞達 生物化工有限公司提供。本實施例中使用的表達乙型肝炎表面抗原基因（S)的DNA疫苗 VR-S2S由解放軍302醫(yī)院提供。
[0049] 實施例3制作以表達乙型肝炎表面抗原基因⑶的腺病毒載體疫苗rMVA_E4為代 表的病毒載體疫苗自溶性微針透皮貼片
[0050] (1)模具的制備：依托表面有484個（22X22行）高約300微米的微針，微針的最 大截面的錐角是45度，底座面積為lcmXlcm的八棱錐形不銹鋼母模模具，取預聚合的聚二 甲基石圭氧燒10克和交聯(lián)劑1克的混合物（SYLGARD184,siliconeelastomer,Dowcorning) 并覆蓋在母模模具上，在溫度為80°C下放置30分鐘左右，得到表面具有與所述的母模模具 上微針針體的形狀和數(shù)量相適配的所需數(shù)量的針孔的模具；
[0051] (2)將20毫克負載有200微克rMVA-E4的PBS溶液與20毫克30重量％的海藻糖 溶液混合均勻，將上述溶液覆蓋到步驟（1)得到的表面有針孔的模具中，在封閉容器中加2 個大氣壓10分鐘，使針體制作液進入到所述的針孔中，將上述模具放于干燥器中，4°C條件 下晾干；
[0052] (3)將低分子量的硫酸乙酰肝素、寡聚透明質(zhì)酸和海藻糖分別按照20重量％、20 重量％，10重量％溶解到水中，作為含疫苗保護劑的基質(zhì)材料制作液，然后將0. 1克該制作 液倒入步驟（2)得到的負載有疫苗的模具中，置于密閉容器中，在模具上方施加2個大氣 壓，維持10分鐘，使所述的針孔中殘存的空氣溢出；然后將覆蓋有基質(zhì)材料制作液的模具 于干燥器中4°C條件下晾干，將干燥后的自溶性微針疫苗貼片取下，得到含有低分子量的硫 酸乙酰肝素和寡聚透明質(zhì)酸的自溶性微針疫苗透皮貼片，自溶性微針針體的高度是300微 米，針尖的角度是45度，針尖直徑是1微米。自溶性微針疫苗貼片中含疫苗200微克，疫苗 保護劑（海藻糖）16毫克，寡聚透明質(zhì)酸和低分子量的硫酸乙酰肝素各20毫克。
[0053] 本實施例中選用的寡聚透明質(zhì)酸的重均分子量為10, 000、低分子量的硫酸乙酰肝 素的重均分子量為10, 〇〇〇,由山東福瑞達生物化工有限公司提供。本實施例中使用表達乙 型肝炎表面抗原基因（S)的腺病毒載體疫苗rMVA-E4由解放軍302醫(yī)院提供。
[0054] 實施例4
[0055] 微針性能的測試：使用壓力測試平臺測試實施例1中制備的自溶性微針針尖可以 承受的壓力。以微針經(jīng)受作用力后微針針尖有輕微變化，但是仍能基本刺穿豬耳朵皮膚角 質(zhì)層（角質(zhì)層被刺穿時，臺盤蘭染色呈藍色）時微針承受的壓力作為自溶性微針針尖可以 承受的最大壓力。結(jié)果如圖3所示，當壓力增大到4N時微針最尖端開始出現(xiàn)輕微損害，而 壓力為2N時100%的針孔都被臺盤蘭染色，表明只需2N的力即可刺穿皮膚，這說明該自溶 性微針貼片具有較高的硬度和刺穿皮膚性能。
[0056] 比較例1
[0057]按照實施例1的制作方法，把寡聚透明質(zhì)酸換成PVP_k30制作乙肝表面抗原HBsAg自溶性微針透皮貼片。PVP-k30由北京國人逸康科技有限公司提供，其余試劑與實施例1相 同。
[0058] 比較例2
[0059] 按照實施例2的制作方法，把低分子量的硫酸乙酰肝素換成PVP_k30制作乙肝DNA 疫苗VR-S2S自溶性微針透皮貼片。PVP-k30由北京國人逸康科技有限公司提供，其余試劑 與實施例2相同。
[0060] 比較例3
[0061]按照實施例3的制作方法，把低分子量的硫酸乙酰肝素和寡聚透明質(zhì)酸的混合物 換成PVP_k30制作重組腺病毒載體乙肝疫苗rMVA-E4自溶性微針透皮貼片。PVP-k30由北 京國人逸康科技有限公司提供，其余試劑與實施例3相同。
[0062] 比較例4
[0063] 按照實施例1的制作方法，把寡聚透明質(zhì)酸（重均分子量4000)換成高分子量透 明質(zhì)酸（重均分子量2X106)制作乙肝表面抗原HBsAg自溶性微針透皮貼片。透明質(zhì)酸（重 均分子量2X106)由山東福瑞達生物化工有限公司提供。
[0064] 比較例5
[0065]按照實施例1的制作方法，把寡聚透明質(zhì)酸（重均分子量4000)換成鋁佐劑，形成 的微針質(zhì)地疏松，無法刺穿皮膚。
[0066]實施例5
[0067] 本實施中是通過小鼠免疫試驗來對實施例1中以寡聚透明質(zhì)酸為微針基質(zhì)的自 溶性微針貼片、比較例1中的以PVP-k30為微針基質(zhì)的自溶性微針貼片以及比較例4中的 以高分子量透明質(zhì)酸為微針基質(zhì)的自溶性微針貼片的免疫效果進行對比。
[0068] (1)免疫
[0069] BALB/c小鼠分為實施例1組、比較例1組、比較例4組、對照組、空白組，每組25只 小鼠。實施例1、比較例1組、比較例4組的小鼠處理前先用剪子將腹部毛去除，然后用手按 壓的方式分別將實施例1中寡聚透明質(zhì)酸為基質(zhì)材料的自溶性微針貼片、比較例1中的以 PVP-k30為微針基質(zhì)的自溶性微針貼片以及比較例4中的以高分子量透明質(zhì)酸為微針基質(zhì) 的自溶性微針貼片作用于小鼠腹部，3分鐘后將貼片取下。每只小鼠用一片貼片處理，每片 貼片含乙肝表面抗原為5微克；對照組肌肉注射含鋁佐劑的重組（酵母）乙型肝炎疫苗，劑 量為每只小鼠0. 4毫克A1 (0H)3吸附5微克乙肝表面抗原；空白組，僅注射生理鹽水，100微 升/只。
[0070] 免疫方案：共免疫3次，分別在0, 2,4周免疫BALB/c小鼠。
[0071] (2#1^八檢測血清抗-耶8186水平
[0072] 在初次免疫后4周，采集小鼠尾靜脈血，分離血清，ELISA檢測血清抗-HBsIgG水 平，按蛋白微孔試劑盒方法進行檢測，具體方法是：40微升HBsAg溶于10毫升1X包被稀 釋液，混勻，包被96孔酶標板，100微升/孔；酶標板放于濕盒，4°C過夜；倒掉孔內(nèi)液體，拍 凈板子；加入1XBSA，200微升/孔；酶標板在37°C濕盒放置1小時；倒掉孔內(nèi)液體，拍凈板 子；血清經(jīng)倍比系列稀釋后，加入酶標板，100微升/孔，37°C濕盒放置1小時；用試劑盒配 制的洗液洗板4次，每次5分鐘，末次拍凈酶標板；加入試劑盒配制的二抗（peroxidase結(jié) 合的羊抗鼠IgG)，100微升/孔，37°C濕盒放置1小時；用洗液洗板4次，每次5分鐘，末次 拍凈酶標板；加入試劑盒配制的顯色液，100微升/孔，避光顯色10~25分鐘。加終止液， 每孔100微升；酶標板放入酶標儀，在405nm處讀板。
[0073] (3)乳酸脫氫酶法檢測細胞毒活性
[0074] 在初次免疫后6周，檢測實施例1組、比較例1組、比較例4組、對照組、空白組誘 導的細胞免疫水平（CTL反應）。
[0075]A.效應細胞制備
[0076] 眼球取血后，快速取出小鼠脾臟，制成細胞懸液，用含質(zhì)量濃度為10%小牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)細胞濃度到l〇7mL。培養(yǎng)1天后，加入5mg/LHBsAgCTL表位、1X106U/ LrmIL-2及5mg/LConA，隔日半量換液，同時添加半量HBsAgCTL表位，rmlL-2及5mg/L ConA。第5天時，收集細胞、計數(shù)，調(diào)整細胞密度至1X106/mL，作為效應細胞。
[0077] B.靶細胞制備
[0078]取對數(shù)生長期的P815細胞（P815傳代后生長Id)，用含10mg/LHBsAgCTL表位的 RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜，加入絲裂霉素至25mg/L，45分鐘后收集細胞，調(diào)整細胞密度至 1X104/孔，作為靶細胞。
[0079]C.CTL活性測定
[0080] 采用96孔圓底塑料培養(yǎng)板進行，每個樣至少設(shè)3個復孔。
[0081] 分組加樣：實驗組每孔加靶細胞懸液和效應細胞懸液各100微升。效應細胞與靶 細胞的比率（效：靶比）取100:1 ;最大釋放組每孔加靶細胞懸液和1%TritonX-100水溶 液各100微升。這樣可使靶細胞完全破壞，胞內(nèi)LDH全部釋放；自發(fā)釋放組每孔加靶細胞懸 液和培養(yǎng)液各100微升。
[0082] 微孔塑料板經(jīng)800轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。置37°C、體積濃度為5%C02培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)5小時；取出微孔板，以2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。從每孔中取出50微升上清液用于 CTL的殺傷活性檢測。
[0083] 檢測方法用乳酸脫氫酶（LDH)法。參照CytoTox96Non-Radioactive CytotoxicityAssay試劑盒說明書進行。