[0084] 計(jì)算方法：Cytotoxicity(%) =(實(shí)驗(yàn)釋放-效自發(fā)釋放-祀自發(fā)釋放）/(革巴最 大釋放-祀自發(fā)釋放）X1〇〇 %
[0085] 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下（用SPSS軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兩組之間差異比較采用配對(duì)t檢 驗(yàn)，結(jié)果采用幾何平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤）：
[0086] 在初次免疫后4周，實(shí)施例1組，比較例1組，比較例4組、對(duì)照組的IoglOIgG水 平分別為3· 86±0· 35,3· 21±0· 24,2· 80±0· 12,3· 30±0· 19 ;而空白組誘導(dǎo)的抗HBs IgG 水平則很低，接近于〇 (見(jiàn)圖4)。在以上各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)施例1組、比較例1組、比較例4組 和對(duì)照組誘導(dǎo)的抗-HBs IgG水平均顯著高于空白組（P〈0. 01)，實(shí)施例1組誘導(dǎo)的抗-HBs IgG水平顯著高于比較例1組、比較例4組和對(duì)照組（P〈0. 05)，比較例1組和對(duì)照組誘導(dǎo)的 抗-HBs IgG水平則無(wú)顯著性差異（P>0. 05)，比較例1組誘導(dǎo)的抗-HBs IgG水平顯著高于 比較例4組。說(shuō)明PVP-k30為基質(zhì)制備的自溶性微針貼片經(jīng)皮免疫能夠達(dá)到含鋁佐劑乙 肝疫苗肌肉注射的免疫效果，寡聚透明質(zhì)酸為基質(zhì)材料制備的自溶性微針的免疫效果優(yōu)于 PVP-k30為基質(zhì)材料制備的自溶性微針貼片經(jīng)皮免疫和含鋁佐劑乙肝疫苗肌肉注射，提示 寡聚透明質(zhì)酸起到了基質(zhì)和佐劑的雙重作用。與此同時(shí)，PVP_k30為基質(zhì)制備的自溶性微 針貼片的免疫效果優(yōu)于以高分子量透明質(zhì)酸為基質(zhì)制備的自溶性微針貼片經(jīng)皮免疫，表明 高分子量透明質(zhì)酸對(duì)免疫應(yīng)答可能有一定的抑制作用。
[0087] 在初次免疫后6周，實(shí)施例1組誘導(dǎo)的CTL活性顯著高于比較例1組、比較例4組、 對(duì)照組和空白組（P〈〇. 01)，而比較例1組、比較例4組、對(duì)照組誘導(dǎo)的CTL活性與空白組無(wú) 顯著差異（P>〇. 05)，見(jiàn)表1。研究結(jié)果說(shuō)明，寡聚透明質(zhì)酸能夠顯著增強(qiáng)自溶性微針中乙肝 表面抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答，顯著優(yōu)于PVP_k30和鋁佐劑。
[0088] 表1寡聚透明質(zhì)酸與乙肝表面抗原免疫誘導(dǎo)的CTL活性（％ )
[0089]
[0090] 實(shí)施例6
[0091] 本實(shí)施例中是通過(guò)小鼠免疫試驗(yàn)來(lái)對(duì)實(shí)施例2中以低分子量硫酸乙酰肝素為基 質(zhì)材料的自溶性微針貼片和比較例2中以PVP-k30為基質(zhì)材料的自溶性微針貼片的免疫效 果進(jìn)行對(duì)比。
[0092] (1)免疫
[0093]BALB/c小鼠分為實(shí)施例2組，比較例2組，對(duì)照組、空白組，每組25只。實(shí)施例2 組和比較例2組的小鼠處理前先用剪子將腹部毛去除，然后用手壓的方式分別將實(shí)施例2 中以低分子量硫酸乙酰肝素為基質(zhì)材料的自溶性微針貼片和比較例2中以PVP-k30為基質(zhì) 材料的自溶性微針貼片作用于小鼠腹部，3分鐘后將貼片取下。每只小鼠用一片貼片處理， 每片貼片含VR-S2S為10微克；對(duì)照組肌肉注射VR-S2S，劑量為每只小鼠10微克VR-S2S; 空白組，僅注射生理鹽水，100微升/只。
[0094] 免疫方案：共免疫3次，分別在0, 2, 4周免疫BALB/c小鼠。
[0095] (2#1^13八檢測(cè)血清抗-耶8186水平
[0096] 在初次免疫后4周，采集小鼠尾靜脈血，分離血清，ELISA檢測(cè)血清抗-HBsIgG水 平，按蛋白微孔試劑盒方法進(jìn)行檢測(cè)，具體方法是：40微升HBsAg溶于10毫升1X包被稀 釋液，混勻，包被96孔酶標(biāo)板，100微升/孔；酶標(biāo)板放于濕盒，4°C過(guò)夜；倒掉孔內(nèi)液體，拍 凈板子；加入1XBSA，200微升/孔；酶標(biāo)板在37°C濕盒放置1小時(shí)；倒掉孔內(nèi)液體，拍凈板 子；血清經(jīng)倍比系列稀釋后，加入酶標(biāo)板，100微升/孔，37°C濕盒放置1小時(shí)；用試劑盒配 制的洗液洗板4次，每次5分鐘，末次拍凈酶標(biāo)板；加入試劑盒配制的二抗（peroxidase結(jié) 合的羊抗鼠IgG)，100微升/孔，37°C濕盒放置1小時(shí)；用洗液洗板4次，每次5分鐘，末次 拍凈酶標(biāo)板；加入試劑盒配制的顯色液，100微升/孔，避光顯色10~25分鐘。加終止液， 每孔100微升；酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀，在405nm處讀板。
[0097] (3)乳酸脫氫酶法檢測(cè)細(xì)胞毒活性
[0098] 在初次免疫后6周，檢測(cè)實(shí)施例2組、比較例2組、對(duì)照組、空白組誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫 水平（CTL反應(yīng)）。
[0099]A.效應(yīng)細(xì)胞制備
[0100] 眼球取血后，快速取出小鼠脾臟，制成細(xì)胞懸液，用含質(zhì)量濃度為10%小牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度到l〇7mL。培養(yǎng)1天后，加入5mg/LHBsAgCTL表位、1X106U/ LrmIL-2及5mg/LConA，隔日半量換液，同時(shí)添加半量HBsAgCTL表位，rmlL-2及5mg/L ConA。第5天時(shí)，收集細(xì)胞、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1X106/mL，作為效應(yīng)細(xì)胞。
[0101] B.靶細(xì)胞制備
[0102]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P815細(xì)胞（P815傳代后生長(zhǎng)Id)，用含10mg/LHBsAgCTL表位的 RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜，加入絲裂霉素至25mg/L，45分鐘后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至 1X104/孔，作為靶細(xì)胞。
[0103]C.CTL活性測(cè)定
[0104] 采用96孔圓底塑料培養(yǎng)板進(jìn)行，每個(gè)樣至少設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
[0105] 分組加樣：實(shí)驗(yàn)組每孔加靶細(xì)胞懸液和效應(yīng)細(xì)胞懸液各100微升。效應(yīng)細(xì)胞與靶 細(xì)胞的比率（效：靶比）取100:1 ;最大釋放組每孔加靶細(xì)胞懸液和1%TritonX-100水溶 液各100微升。這樣可使靶細(xì)胞完全破壞，胞內(nèi)LDH全部釋放；自發(fā)釋放組每孔加靶細(xì)胞懸 液和培養(yǎng)液各100微升。
[0106] 微孔塑料板經(jīng)800轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。置37°C、體積濃度為5%C02培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)5小時(shí)；取出微孔板，以2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。從每孔中取出50微升上清液用于 CTL的殺傷活性檢測(cè)。
[0107]檢測(cè)方法用乳酸脫氫酶（LDH)法。參照CytoTox96Non_RadioactiveCytotoxicity Assay試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0108] 計(jì)算方法：Cytotoxicity(%) =(實(shí)驗(yàn)釋放-效自發(fā)釋放-祀自發(fā)釋放）/(革巴最 大釋放-祀自發(fā)釋放）X100 %
[0109] 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下（用SPSS軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，兩組之間差異比較采用配對(duì)t檢 驗(yàn)，結(jié)果采用幾何平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤）：
[0110] 在初次免疫后4周，實(shí)施例2組，比較例2組，對(duì)照組的IoglOIgG水平分別為 3. 24±0. 16,2. 63±0. 11，2. 72±0. 12 ;而空白組誘導(dǎo)的抗HBs IgG水平則很低，接近于 0(見(jiàn)圖5)。在以上各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)施例2組、比較例2組和對(duì)照組誘導(dǎo)的抗-HBs IgG水平 均顯著高于空白組（P〈〇. 01)，實(shí)施例2組誘導(dǎo)的抗-HBs IgG水平顯著高于比較例2組和對(duì) 照組（P〈0. 05)，而比較例2組和對(duì)照組誘導(dǎo)的抗-HBs IgG水平則無(wú)顯著性差異（P>0. 05)。 說(shuō)明低分子量的硫酸乙酰肝素為基質(zhì)材料制備的自溶性微針的免疫效果優(yōu)于PVP_k30為 基質(zhì)材料制備的自溶性微針貼片經(jīng)皮免疫和肌肉注射免疫。提示低分子量的硫酸乙酰肝素 起到了基質(zhì)材料和佐劑的雙重作用。
[0111] 在初次免疫后6周，實(shí)施例2組誘導(dǎo)的CTL活性顯著高于比較例2組、對(duì)照組和空 白組（P〈0. 01)，而比較例2組、對(duì)照組誘導(dǎo)的CTL活性與空白組無(wú)顯著差異（P>0. 05)，見(jiàn)表 2。研究結(jié)果說(shuō)明，低分子量的硫酸乙酰肝素能夠顯著增強(qiáng)自溶性微針中乙肝DNA疫苗的細(xì) 胞免疫應(yīng)答，顯著優(yōu)于PVP-k30為基質(zhì)材料的自溶性微針經(jīng)皮免疫和肌肉注射免疫。
[0112] 表2乙肝DNA疫苗免疫誘導(dǎo)的CTL活性（％ )
[0113]
[0114] 實(shí)施例7
[0115] 本實(shí)施例中是通過(guò)小鼠免疫試驗(yàn)來(lái)對(duì)實(shí)施例3中以寡聚透明質(zhì)酸和低分子量硫 酸乙酰肝素為基質(zhì)材料的自溶性微針貼片和比較例3中的以PVP_k30為基質(zhì)材料的自溶性 微針貼片的免疫效果進(jìn)行對(duì)比。
[0116] (1)免疫
[0117] BALB/c小鼠分為實(shí)施例3組，比較例3組，對(duì)照組、空白組，每組25只。實(shí)施例3 組和比較例3組的小鼠處理前先用剪子將腹部毛去除，然后用手壓的方式分別將實(shí)施例3 中以寡聚透明質(zhì)酸和低分子量的硫酸乙酰肝素為基質(zhì)材料的自溶性微針貼片和比較例3 中的以PVP-k30為基質(zhì)材料的自溶性微針貼片作用于小鼠腹部，3分鐘后將貼片取下。每只 小鼠用一片貼片處理，每片貼片含rMVA-E4為20微克；對(duì)照組肌肉注射rMVA-E4,劑量為每 只小鼠20微克rMVA-E4 ;空白組，僅注射生理鹽水，100微升/只。
[0118] 免疫方案：共免疫3次，分別在0, 2, 4周免疫BALB/c小鼠。
[0119] (2)ELISA檢測(cè)血清抗-HBsIgG水平
[0120] 在初次免疫后4周，采集小鼠尾靜脈血，分離血清，ELISA檢測(cè)血清抗-HBs IgG水 平，按蛋白微孔試劑盒方法進(jìn)行檢測(cè)，具體方法是：40微升HBsAg溶于10毫升1X包被稀 釋液，混勻，包被96孔酶標(biāo)板，100微升/孔；酶標(biāo)板放于濕盒，4°C過(guò)夜；倒掉孔內(nèi)液體，拍 凈板子；加入1 XBSA，200微升/孔；酶標(biāo)板在37°C濕盒放置1小時(shí)；倒掉孔內(nèi)液體，拍凈板 子；血清經(jīng)倍比系列稀釋后，加入酶標(biāo)板，100微升/孔，37°