C濕盒放置1小時；用試劑盒配 制的洗液洗板4次，每次5分鐘，末次拍凈酶標(biāo)板；加入試劑盒配制的二抗（peroxidase結(jié) 合的羊抗鼠IgG)，100微升/孔，37°C濕盒放置1小時；用洗液洗板4次，每次5分鐘，末次 拍凈酶標(biāo)板；加入試劑盒配制的顯色液，100微升/孔，避光顯色10~25分鐘。加終止液， 每孔100微升；酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀，在405nm處讀板。
[0121] (3)乳酸脫氫酶法檢測細(xì)胞毒活性
[0122] 在初次免疫后6周，檢測實施例3組、比較例3組、對照組、空白組誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫 水平（CTL反應(yīng)）。
[0123]A.效應(yīng)細(xì)胞制備
[0124] 眼球取血后，快速取出小鼠脾臟，制成細(xì)胞懸液，用含質(zhì)量濃度為10%小牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度到l〇7mL。培養(yǎng)1天后，加入5mg/LHBsAgCTL表位、1X106U/ LrmIL-2及5mg/LConA，隔日半量換液，同時添加半量HBsAgCTL表位，rmlL-2及5mg/L ConA。第5天時，收集細(xì)胞、計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1X106/mL，作為效應(yīng)細(xì)胞。
[0125] B.靶細(xì)胞制備
[0126]取對數(shù)生長期的P815細(xì)胞（P815傳代后生長Id)，用含10mg/LHBsAgCTL表位的 RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜，加入絲裂霉素至25mg/L，45分鐘后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至 1X104/孔，作為靶細(xì)胞。
[0127]C.CTL活性測定
[0128] 采用96孔圓底塑料培養(yǎng)板進(jìn)行，每個樣至少設(shè)3個復(fù)孔。
[0129] 分組加樣：實驗組每孔加靶細(xì)胞懸液和效應(yīng)細(xì)胞懸液各100微升。效應(yīng)細(xì)胞與靶 細(xì)胞的比率（效：靶比）取100:1 ;最大釋放組每孔加靶細(xì)胞懸液和1%TritonX-100水溶 液各100微升。這樣可使靶細(xì)胞完全破壞，胞內(nèi)LDH全部釋放；自發(fā)釋放組每孔加靶細(xì)胞懸 液和培養(yǎng)液各100微升。
[0130] 微孔塑料板經(jīng)800轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。置37°C、體積濃度為5%C02培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)5小時；取出微孔板，以2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。從每孔中取出50微升上清液用于 CTL的殺傷活性檢測。
[0131]檢測方法用乳酸脫氫酶（LDH)法。參照CytoTox96Non_RadioactiveCytotoxicity Assay試劑盒說明書進(jìn)行。
[0132] 計算方法：Cytotoxicity(%) =(實驗釋放-效自發(fā)釋放-祀自發(fā)釋放）/(革巴最 大釋放-祀自發(fā)釋放）X1〇〇 %
[0133] 動物實驗結(jié)果如下（用SPSS軟件分析實驗結(jié)果，兩組之間差異比較采用配對t檢 驗，結(jié)果采用幾何平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤）：
[0134] 在初次免疫后4周，實施例3組，比較例3組，對照組的IoglOIgG水平分別為 2.51±0. 18，1.70±0. 10，1.62±0. 14;而空白組誘導(dǎo)的抗HBsIgG水平則很低，接近于 0 (見圖6)。在以上各個時間點，實施例3組、比較例3組和對照組誘導(dǎo)的抗-HBsIgG水平 均顯著高于空白組（P〈〇. 01)，實施例3組誘導(dǎo)的抗-HBsIgG水平顯著高于比較例3組和對 照組（P〈0. 05)，而比較例3組和對照組誘導(dǎo)的抗-HBsIgG水平則無顯著性差異（P>0. 05)。 說明寡聚透明質(zhì)酸和低分子量的硫酸乙酰肝素為基質(zhì)材料制備的自溶性微針的免疫效果 優(yōu)于PVP-k30為基質(zhì)材料制備的自溶性微針貼片經(jīng)皮免疫和rMVA-E4肌肉注射。提示寡聚 透明質(zhì)酸和低分子量的硫酸乙酰肝素起到了基質(zhì)材料和佐劑的雙重作用。
[0135] 在初次免疫后6周，實施例3組誘導(dǎo)的CTL活性顯著高于比較例2組、對照組和空 白組（P〈0. 01)，而比較例3組、對照組誘導(dǎo)的CTL活性與空白組無顯著差異（P>0. 05)，見表 3。研究結(jié)果說明，寡聚透明質(zhì)酸和低分子量的硫酸乙酰肝素能夠顯著增強自溶性微針中乙 肝病毒載體疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答，顯著優(yōu)于PVP_k30為基質(zhì)材料的自溶性微針經(jīng)皮免疫和 肌肉注射免疫。
[0136] 表3重組腺病毒載體乙肝疫苗免疫誘導(dǎo)的CTL活性（％ )
[0137]
【主權(quán)項】
1. 一種自溶性微針透皮貼片，其特征是：所述的自溶性微針透皮貼片是由微針基質(zhì)材 料、疫苗、疫苗佐劑和疫苗保護(hù)劑構(gòu)成，其中，所述的微針基質(zhì)材料和疫苗佐劑均為寡聚透 明質(zhì)酸、低分子量的硫酸乙酰肝素或其組合。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自溶性微針透皮貼片，其特征是：所述的疫苗在所述的自溶 性微針透皮貼片中所占的百分含量為總重量的0.001%~10%，疫苗保護(hù)劑在所述的自溶 性微針透皮貼片中所占的百分含量為總重量的0.01%~30%，微針基質(zhì)材料和疫苗佐劑 在所述的自溶性微針透皮貼片中所占的百分含量為總重量的60%~99. 98%。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的自溶性微針透皮貼片，其特征是：所述的疫苗在所述的自溶 性微針透皮貼片中所占的百分含量為總重量的〇. 01 %~1 %，疫苗保護(hù)劑在所述的自溶性 微針透皮貼片中所占的百分含量為總重量的0. 1%~20%，微針基質(zhì)材料和疫苗佐劑在所 述的自溶性微針透皮貼片中所占的百分含量為總重量的80%~99. 8%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的自溶性微針透皮貼片，其特征是：所述的疫苗保護(hù)劑 選自甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、聚糖、糊精、人血清白蛋白、明膠、 精氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸鹽酸鹽、肌氨酸、L-絡(luò)氨 酸、苯丙氨酸中的至少一種。5. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的自溶性微針透皮貼片，其特征是：所述的寡聚透明質(zhì) 酸的重均分子量在10, 〇〇〇以內(nèi)；所述的低分子量的硫酸乙酰肝素的重均分子量在10, 〇〇〇 以內(nèi)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的自溶性微針透皮貼片，其特征是：所述的寡聚透明質(zhì)酸的重 均分子量的范圍是5000〈重均分子量〈10,000 ;所述的低分子量的硫酸乙酰肝素的重均分 子量的范圍是4000〈重均分子量〈10,000。7. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的自溶性微針透皮貼片，其特征是：所述的疫苗選自減 毒活疫苗、亞單位疫苗、多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗中的一種。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的自溶性微針透皮貼片，其特征是：所述的減毒活疫苗選自麻 疹疫苗、風(fēng)疹疫苗、腮腺炎疫苗、卡介苗、乙腦減毒活疫苗、手足口疫苗中的一種； 所述的亞單位疫苗是乙肝疫苗或流感疫苗； 所述的多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)疫苗選自肺炎球菌疫苗、A群流腦疫苗、A+C群流腦疫苗中的 一種； 所述的DNA疫苗是表達(dá)乙型肝炎表面抗原基因（S)的DNA疫苗； 所述的病毒載體疫苗是具有疫苗性質(zhì)的重組活病毒疫苗；所述的重組活病毒疫苗是痘 病毒載體疫苗或腺病毒載體疫苗。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的自溶性微針透皮貼片，其特征是：所述的痘病毒載體疫苗是 表達(dá)乙型肝炎表面抗原基因（S)的痘病毒載體疫苗；所述的腺病毒載體疫苗是表達(dá)乙型肝 炎表面抗原基因（S)的腺病毒載體疫苗。10. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的自溶性微針透皮貼片，其特征是：所述的自溶性微針 透皮貼片的規(guī)格為每平方厘米含有16~484根微針，每根微針的截面形狀是圓錐形或多面 錐形，微針的高度在150~1000微米之間，針尖的直徑在100納米~20微米之間，微針的 最大截面的錐角是20~60度。11. 一種權(quán)利要求1~10任意一項所述的自溶性微針透皮貼片的制備方法，其特征是， 所述的制備方法包括以下步驟： (1) 制備含有疫苗和疫苗保護(hù)劑的水溶液； (2) 制備含有微針基質(zhì)材料和疫苗佐劑的水溶液； (3) 將步驟（1)制備的含有疫苗和疫苗保護(hù)劑的水溶液澆注到含有微孔陣列的模具 上；使步驟（1)制備的含有疫苗和疫苗保護(hù)劑的水溶液填充到模具上的微孔中；干燥澆注 的含有疫苗和疫苗保護(hù)劑的水溶液； (4) 將步驟（2)制備的含有微針基質(zhì)材料和疫苗佐劑的水溶液澆注到步驟（3)干燥后 的模具上；使步驟（2)制備的含有微針基質(zhì)材料和疫苗佐劑的水溶液填充到含有疫苗和疫 苗保護(hù)劑的水溶液干燥后塌陷出的微孔中；干燥澆注的含有微針基質(zhì)材料和疫苗佐劑的水 溶液，在含有微孔陣列的模具中得到自溶性微針透皮貼片；從所述的模具上剝離干燥后的 自溶性微針透皮貼片。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的的制備方法，其特征是：所述的含有微孔陣列的模具是由 聚二甲基硅氧烷制備而成的板，其每平方厘米表面含有16~484個微孔陣列，每個微孔的 截面形狀是圓錐形或多面錐形，微孔的高度在150~1000微米之間，孔尖的直徑在100納 米~20微米之間，微孔的最大截面的錐角是20~60度。
【專利摘要】本發(fā)明屬于經(jīng)皮給藥技術(shù)領(lǐng)域中的自溶性微針，特別涉及自溶性微針透皮貼片及其制備方法。本發(fā)明通過將內(nèi)源性的寡聚透明質(zhì)酸和/或低分子量硫酸乙酰肝素同時作為微針基質(zhì)材料和疫苗佐劑制備自溶性微針，并將疫苗負(fù)載于其中，從而獲得本發(fā)明的自溶性微針疫苗透皮貼片。本發(fā)明的自溶性微針透皮貼片可實現(xiàn)疫苗的有效經(jīng)皮免疫，增強疫苗的體液免疫應(yīng)答。并且與現(xiàn)有肌肉注射免疫以及其他自溶性微針經(jīng)皮免疫相比，能夠顯著增強疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
【IPC分類】A61K39/39, A61K9/70, A61K47/36, A61P37/04
【公開號】CN105311000
【申請?zhí)枴緾N201410301920
【發(fā)明人】高云華, 邱玉琴
【申請人】中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2014年6月27日