序列表的序 列16所示的單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)HPV-39B(用于鑒定HPV-39)由序列表的序列 17所示的單鏈DNA分子和序列表的序列18所示的單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)HPV-45B (用于鑒定HPV-45)由序列表的序列19所示的單鏈DNA分子和序列表的序列20所示的單 鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)HPV-51B(用于鑒定HPV-51)由序列表的序列21所示的單 鏈DNA分子和序列表的序列22所示的單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)HPV-52B(用于鑒定 HPV-52)由序列表的序列23所示的單鏈DNA分子和序列表的序列24所示的單鏈DNA分子 組成；所述引物對(duì)HPV-53B(用于鑒定HPV-53)由序列表的序列25所示的單鏈DNA分子和 序列表的序列26所示的單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)HPV-56B(用于鑒定HPV-56)由序 列表的序列27所示的單鏈DNA分子和序列表的序列28所示的單鏈DNA分子組成；所述引 物對(duì)HPV-58B(用于鑒定HPV-58)由序列表的序列29所示的單鏈DNA分子和序列表的序 列30所示的單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)HPV-59B(用于鑒定HPV-59)由序列表的序列 31所示的單鏈DNA分子和序列表的序列32所示的單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)HPV-66B (用于鑒定HPV-66)由序列表的序列33所示的單鏈DNA分子和序列表的序列34所示的單 鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)HPV-68B(用于鑒定HPV-68)由序列表的序列35所示的單 鏈DNA分子和序列表的序列36所示的單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)HPV-70B(用于鑒定 HPV-70)由序列表的序列37所示的單鏈DNA分子和序列表的序列38所示的單鏈DNA分子 組成；所述引物對(duì)HPV-73B(用于鑒定HPV-73)由序列表的序列39所示的單鏈DNA分子和 序列表的序列40所示的單鏈DNA分子組成；所述引物對(duì)HPV-81B(用于鑒定HPV-81)由序 列表的序列41所示的單鏈DNA分子和序列表的序列36所示的單鏈DNA分子組成；所述引 物對(duì)HPV-82B(用于鑒定HPV-82)由序列表的序列42所示的單鏈DNA分子和序列表的序列 43所示的單鏈DNA分子組成；
[0037] 所述通用芯片上分別固定有序列表的序列46至序列表的序列67所示的22條探 針。
[0038] 所述引物組可由引物組合物甲和引物組合物乙組成；所述引物組合物甲由所述 引物對(duì)HPV-6A、所述引物對(duì)HPV-11A、所述引物對(duì)HPV-18A、所述引物對(duì)HPV-26A、所述引 物對(duì)HPV-31A、所述引物對(duì)HPV-33A、所述引物對(duì)HPV-39A、所述引物對(duì)HPV-45A、所述引物 對(duì)HPV-51A、所述引物對(duì)HPV-52A、所述引物對(duì)HPV-53A、所述引物對(duì)HPV-56A、所述引物 對(duì)HPV-58A、所述引物對(duì)HPV-59A、所述引物對(duì)HPV-66A、所述引物對(duì)HPV-68A、所述引物對(duì) HPV-73A和所述引物對(duì)HPV-81A組成；所述引物組合物乙由所述引物對(duì)HPV-16A、所述引物 對(duì)HPV-35A、所述引物對(duì)HPV-70A和所述引物對(duì)HPV-82A組成。
[0039] 所述引物組還可包括引物對(duì)GAPDHB(用于鑒定GAPDH內(nèi)參基因）；所述引物對(duì) GAPDHB由序列表的序列44所示的單鏈DNA分子和序列表的序列45所示的單鏈DNA分子組 成。所述引物對(duì)GAPDHB可與所述引物組合物甲組合使用，也可與所述引物組合物乙組合使 用。所述所述通用芯片上還可固定有序列表的序列68所示的探針。
[0040] 所述通用芯片上還可固定有QC、BC、PC和NC。QC(表面化學(xué)質(zhì)控探針）是一端帶 有Hex標(biāo)記，另一端具有氨基修飾的寡核苷酸探針，用于觀察芯片點(diǎn)樣和固定的效率，其核 苷酸序列為NH2-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-Hex。BC(空白對(duì)照）為基因點(diǎn)樣液，用于質(zhì)控點(diǎn)樣 過程中有無(wú)樣品殘留污染。PC(雜交質(zhì)控探針)是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，可以與雜 交液中添加的熒光標(biāo)記的互補(bǔ)序列（C-PC)雜交，用于雜交過程的質(zhì)控，其核苷酸序列為NH 2-TTTTTTTTTTTTCCTCAACGGAAGCAAGTGAT。NC(陰性對(duì)照探針)是一段氨基修飾的寡核苷酸探 針，與雜交液中的所有待檢測(cè)序列均不會(huì)雜交，用于觀察有無(wú)非特異雜交，其核苷酸序列為 nh2-ttttttttttttgttgcttctggaatgagtttgct。
[0041] 所述試劑盒的所述引物組中，各個(gè)下游引物上具有熒光分子、可通過化學(xué)發(fā)光進(jìn) 行標(biāo)記檢測(cè)的分子或可通過固體微粒進(jìn)行標(biāo)記檢測(cè)的分子。具體來(lái)說(shuō)，各個(gè)下游引物的5' 末端可具有熒光染料TAMRA修飾。
[0042] 所述試劑盒的功能為如下（a)或（b)或（c)或（d) : (a)輔助鑒定待測(cè)人乳頭瘤病 毒為哪種人乳頭瘤病毒；（b)輔助鑒定人乳頭瘤病毒；（c)輔助檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有人 乳頭瘤病毒；（d)輔助鑒定含有人乳頭瘤病毒的待測(cè)樣本中的人乳頭瘤病毒為哪種人乳頭 瘤病毒。
[0043] 以上任一所述的人乳頭瘤病毒可為HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-26、 HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-56、HPV-58、HPV-59、 HPV-66、HPV-68、HPV-70、HPV-73、HPV-81 或HPV-82。
[0044] 所述通用芯片的基片的材質(zhì)可為硅、玻璃、塑料、水凝膠、硝酸纖維或尼龍。所述通 用芯片的基片具體可為醛基化修飾的玻璃片。
[0045] 微陣列技術(shù)的發(fā)展使得高通量地并行分析成千上萬(wàn)的分子相互作用成為可能。固 定于微陣列芯片的特定核苷酸探針，充當(dāng)解碼工具，通過空間上不同的位置把溶液中并行 反應(yīng)產(chǎn)生的多個(gè)靶標(biāo)分子加以區(qū)別。微陣列方法與多重PCR結(jié)合在一起，可用于檢測(cè)基因 有無(wú)、基因突變(包括單堿基突變、堿基刪除、插入以及長(zhǎng)片段缺失)。
[0046] 在檢測(cè)基因有無(wú)（比如檢測(cè)樣品中有無(wú)微生物的基因存在）與基因突變，尤其是臨 床相關(guān)的檢測(cè)時(shí)，非常關(guān)注提高芯片檢測(cè)的靈敏度和特異性。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的主要障礙在 于，由于標(biāo)記的靶標(biāo)核酸與固定于芯片表面的寡核苷酸探針之間的雜交反應(yīng)是影響芯片檢 測(cè)關(guān)鍵因素。
[0047] 應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒時(shí)，采用兩個(gè)PCR反應(yīng)體系，一個(gè)PCR反應(yīng)體系采用所述引物 組合物甲，另一個(gè)PCR反應(yīng)體系采用所述引物組合物乙。所述引物對(duì)GAPDHB可與所述引物 組合物甲組合使用，也可與所述引物組合物乙組合使用。每個(gè)PCR反應(yīng)體系中都具有多個(gè) 引物對(duì)，且上游引物和下游引物采用不同的濃度，即多重不對(duì)稱PCR反應(yīng)。
[0048] 應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒時(shí)，待檢樣本可為：待檢宮頸樣本可為用無(wú)菌棉拭子或?qū)m頸 刷取疑似人乳頭瘤病毒感染患者的宮頸脫落細(xì)胞，這些樣本須在低于40C的環(huán)境下運(yùn)送到 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，并置于-700C或-200C冷凍保存。
[0049] 本發(fā)明提供的試劑盒，可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)臨床樣品中的人乳頭瘤病毒亞型，通量 大、靈敏度高、特異性強(qiáng)，對(duì)于人乳頭瘤病毒的早期診斷和宮頸癌的早期預(yù)防有重要意義， 可廣泛用于臨床高效診斷和女性體檢。
【附圖說(shuō)明】
[0050] 圖1為6型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0051] 圖2為11型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0052] 圖3為16型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0053] 圖4為18型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0054] 圖5為26型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0055] 圖6為31型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0056]圖7為33型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0057]圖8為35型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0058]圖9為39型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0059]圖10為45型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0060] 圖11為51型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0061] 圖12為52型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0062] 圖13為53型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0063] 圖14為56型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0064] 圖15為58型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0065] 圖16為59型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0066] 圖17為66型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0067] 圖18為68型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0068] 圖19為70型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0069] 圖20為73型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0070] 圖21為81型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0071] 圖22為82型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0072] 圖23為40型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0073] 圖24為42型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0074] 圖25為43型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0075] 圖26為44型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0076] 圖27為54型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0077] 圖28為61型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0078] 圖29為72型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0079] 圖30為83型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。
[0080] 圖31為SP-001的檢測(cè)結(jié)果。
[0081] 圖32為SP-041的檢測(cè)結(jié)果。
[0082] 圖33為通用芯片的探針點(diǎn)陣排布示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0083] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。
[0084] 實(shí)施例1、試劑盒的組成
[0085] 本發(fā)明提供的HPV分型試劑盒包括引物組合物和通用芯片。
[0086] 一、引物組合物
[0087]引物組合物由23個(gè)引物對(duì)組成，下劃線標(biāo)注的區(qū)域?yàn)門ag序列，下游引物的5'末 端具有熒光染料TAMRA修飾。
[0088] 1、用于鑒定HPV-6的引物對(duì)如下（5, 一 3，）：
[0089]上游引物：GAGGAGATCGTAGCTGGTGCATATAATCAGAATTGGTGTATGTGG(序列表的序列 1);
[0090]下游引物：GCCCAGGGACATAACAATGG(序列表的序列2)。
[0091] 2、用于鑒定HPV-11的引物對(duì)如下（5,一3，）：
[0092]上游引物：GCACGAGTTGGGTGAGTTTGGGTGTATGTAGCAGATTTAGACAC(序列表的序列3);
[0093]下游引物：GCTCAGGGACATAACAATGG(序列表的序列4)。
[0094] 3、用于鑒定HPV-16的引物對(duì)如下（5,一3'）：
[0095]上游引物：CGCAGGAGTCGTTAGATGGCTATGTAGTTTCTGAAGTAGATATGG (序列表的序列 5)；
[0096]下游引物：GCACAGGGCCACAATAATGG(序列表的序列6)。
[0097] 4、用于鑒定HPV-18的引物對(duì)如下（5,一3'）：
[0098]上游引物：GCTCGAAGAGGCGCTACAGATCCCATATTGCCCAGGTACAGGAG(序列表的序列7);
[0099]下游引物：GCACAGGGTCATAA