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      從羧酸或二羧酸或其單酯生產(chǎn)胺和二胺的制作方法

      文檔序號(hào):9221192閱讀:799來源:國知局
      從羧酸或二羧酸或其單酯生產(chǎn)胺和二胺的制作方法
      【專利說明】從羧酸或二羧酸或其單酯生產(chǎn)胺和二胺
      [0001] 本發(fā)明涉及全細(xì)胞催化劑,其表達(dá)重組α -雙加氧酶和/或由重組脂肪酸還原酶 和將所述脂肪酸還原酶磷酸泛酰巰基乙胺基化的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶構(gòu)成的組合, 且其另外表達(dá)轉(zhuǎn)氨酶,其中所述磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶和/或轉(zhuǎn)氨酶優(yōu)選地為重組 體;還涉及用于將羧酸或二羧酸或其單酯轉(zhuǎn)化成胺或二胺的方法,所述方法包括下述步驟: 使所述羧酸或二羧酸或其單酯與磷酸泛酰巰基乙胺基化的脂肪酸還原酶或α-雙加氧酶 接觸,和使產(chǎn)物與轉(zhuǎn)氨酶接觸。
      [0002] 聚酰胺是一類以重復(fù)的酰胺基為特征的聚合物。不同于化學(xué)上有關(guān)的蛋白,術(shù)語 "聚酰胺"通常涉及合成的、商購可得的熱塑性聚合物。聚酰胺衍生自伯胺或仲胺,所述伯胺 或仲胺常規(guī)地在烴裂化中得到。但是,衍生物(更精確地講,氨基羧酸、內(nèi)酰胺和二胺)也可 以用于聚合物生產(chǎn)。作為反應(yīng)物(Edukt)也感興趣的是短鏈氣態(tài)烷烴,其可以通過生物技 術(shù)方法從可再生原料開始得到。
      [0003] 這樣的胺和二胺的常規(guī)化學(xué)技術(shù)生產(chǎn)依賴于化石原料的供給,且是低效的,并且 在該過程中形成大量不希望的副產(chǎn)物,在一些合成步驟中最多達(dá)80%。這樣的過程的一個(gè)例 子是月桂內(nèi)酰胺的生產(chǎn)。常規(guī)地,這通過多級(jí)過程來實(shí)現(xiàn),所述多級(jí)過程不僅產(chǎn)生低產(chǎn)率, 而且同時(shí)需要復(fù)雜的基礎(chǔ)設(shè)施。
      [0004] 由于所述缺點(diǎn),已經(jīng)開發(fā)了使用生物催化劑從可再生原料得到胺和二胺的方法。 合適的可再生原料尤其是脂肪酸源,其可以以下述形式得到:油菜籽油、球花薊油、棕櫚仁 油、椰子油、葵花子油和得自許多生物學(xué)來源(尤其是植物)的類似天然產(chǎn)物。
      [0005] PCT/EP 2008/067447描述了使用細(xì)胞來生產(chǎn)化學(xué)上相似的產(chǎn)物(更精確講, ω -氨基羧酸)的生物技術(shù)體系,所述細(xì)胞具有許多合適的酶活性,且能夠?qū)Ⅳ人徂D(zhuǎn)化成相 應(yīng)的ω-氨基羧酸。所述方法包括酶促催化反應(yīng)的級(jí)聯(lián),尤其是將末端碳原子處的脂肪酸 氧化為醛,隨后使用轉(zhuǎn)氨酶和作為胺供體的氨基酸進(jìn)行胺化,所述胺供體可以通過氨基酸 脫氫酶再生。
      [0006] 但是,在其中使用的得自惡臭假單胞菌(/kewt/offimas GPOl的AlkBGT氧 化酶體系的已知缺點(diǎn)在于,它不能執(zhí)行脂族烷烴至伯醇的選擇性氧化。相反,產(chǎn)生大量氧 化產(chǎn)物,尤其是,更高度氧化的產(chǎn)物(諸如相應(yīng)的醛、酮或相應(yīng)的羧酸)的比例隨著反應(yīng)時(shí)間 的增加而增加(C. Grant, J. M. Woodley 和 F. Baganz (2011),萬似7膨 48,480-486),這會(huì)相應(yīng)地降低期望的胺的產(chǎn)率。
      [0007] 由于形成的氧化產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上非常類似,加重了相對(duì)非選擇性氧化的問題。這造 成非常難以有效地和沒有顯著產(chǎn)率損失地將它們與期望的氧化產(chǎn)物分離。
      [0008] 該方法的另一個(gè)缺點(diǎn)在于,過度氧化的副產(chǎn)物(例如用作反應(yīng)物的脂肪酸的二羧 酸)、疏水溶劑和疏水液體陽離子交換劑(根據(jù)PCT/EP2011/071491,其可以用于從水性反應(yīng) 混合物中分離產(chǎn)物)的回收是以資源利用效率為代價(jià)。
      [0009] 在這方面,應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是,如PCT/EP2008/067447所述的具有反應(yīng)級(jí)聯(lián)(其中每一 種反應(yīng)由一種特定的酶催化)的生物技術(shù)體系的復(fù)雜性使得難以優(yōu)化反應(yīng)條件。例如,在基 本上以反應(yīng)性的ω-氨基脂肪酸作為產(chǎn)物的情況下,存在從細(xì)胞內(nèi)部的某一臨界濃度起它 們將與生物體的必需組分反應(yīng)并因而具有毒性效應(yīng)的可能性。如果是這種情況,那么生物 體的生長和合成能力會(huì)受損,直至導(dǎo)致細(xì)胞的死亡,而開發(fā)者不能直接識(shí)別毒性或甚至將 它歸因于特定反應(yīng)物、中間產(chǎn)物或產(chǎn)物。也難以預(yù)測何種生物體耐受化學(xué)反應(yīng)性物質(zhì)的何 種濃度。
      [0010] 關(guān)于要提高的產(chǎn)物產(chǎn)率和要減少的副產(chǎn)物形成,本領(lǐng)域技術(shù)人員也不能常規(guī)地鑒 別體系(諸如在PCT/EP2008/067447中描述的體系)中的限制性因素和決定性因素。如果 產(chǎn)物產(chǎn)率過低,那么這可能是因?yàn)槊钢灰赃^低的濃度存在,而不知道這是可能的酶中的 哪一種,即由于合成能力不足,在預(yù)定的時(shí)間范圍內(nèi)或在被競爭酶降解之前,反應(yīng)物未被轉(zhuǎn) 化?;蛘?,可能是由于,盡管可檢測到一種酶在細(xì)胞中以多肽的形式存在,但是恰好在該細(xì) 胞中不具有為活性所必需的折疊,或者缺乏迄今未知的、但是為活性所必需的輔因子。同樣 地,如已提及的,代謝產(chǎn)物可能是對(duì)細(xì)胞有毒的,或者被降解。最后,必須考慮與內(nèi)源酶(即 在用作全細(xì)胞催化劑的細(xì)胞中天然存在的酶)的干擾性相互作用。
      [0011] 因此存在對(duì)由脂肪酸生產(chǎn)烷基單胺和-二胺的方法的需求,在該方法中酶促催化 的反應(yīng)更選擇性地進(jìn)行,并且使不希望的副產(chǎn)物的形成最小化。
      [0012] 在該背景下,本發(fā)明的目的是,提供在產(chǎn)率、碳-和/或氮平衡和/或純度方面盡 可能有效的由脂肪酸生產(chǎn)烷基單胺和-二胺的生物技術(shù)方法。
      [0013] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是,提供在產(chǎn)率、碳-和/或氮平衡、所使用的試劑的可重復(fù) 使用性和/或產(chǎn)物的純度方面盡可能有效的由脂肪酸生產(chǎn)烷基單胺和-二胺的生物技術(shù)方 法。在這方面,有效的碳-和/或氮平衡優(yōu)選地被理解為是指,在期望的終產(chǎn)物中以盡可能 高的比例重新找到為轉(zhuǎn)化羧酸或羧酸酯以合適的底物的形式喂養(yǎng)給細(xì)胞的碳和/或氮,而 不是例如轉(zhuǎn)化成不期望的產(chǎn)物。
      [0014] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是,改善得自由脂肪酸生產(chǎn)烷基單胺和-二胺的多相反應(yīng)混 合物的可處理性,尤其是在用于處理使用過的疏水溶劑和液體陽離子交換劑的可重復(fù)使用 性方面,以及在兩相體系中的相形成和相分離方面,所述兩相體系包含水相(在其中進(jìn)行羧 酸或羧酸酯的轉(zhuǎn)化)和有機(jī)相(其含有有機(jī)溶劑和/或液體陽離子交換劑)。
      [0015] 本申請的主題和尤其是附帶的獨(dú)立權(quán)利要求的主題的主題實(shí)現(xiàn)了這些和其它目 的,其中由從屬權(quán)利要求獲悉實(shí)施方案。
      [0016] 在第一方面中通過全細(xì)胞催化劑解決了作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的問題,所述全細(xì)胞催 化劑表達(dá)重組α-雙加氧酶或由重組脂肪酸還原酶和由將所述脂肪酸還原酶磷酸泛酰巰 基乙胺基化的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶構(gòu)成的組合,且其另外表達(dá)轉(zhuǎn)氨酶,其中所述磷 酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶和/或轉(zhuǎn)氨酶優(yōu)選地為重組體。
      [0017] 在第一方面的第一個(gè)實(shí)施方案中通過全細(xì)胞催化劑解決了所述問題,所述全細(xì)胞 催化劑另外表達(dá)氨基酸脫氫酶,所述氨基酸脫氫酶優(yōu)選地為重組體。
      [0018] 在第二個(gè)實(shí)施方案中,其也是第一個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案,通過全細(xì)胞催化 劑解決了所述問題,所述全細(xì)胞催化劑另外表達(dá)烷烴羥化酶,所述烷烴羥化酶優(yōu)選地為重 組體。
      [0019] 在第三個(gè)實(shí)施方案中,其也是第一至第二個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案,通過全細(xì) 胞催化劑解決了所述問題,所述全細(xì)胞催化劑另外表達(dá)AlkL家族的多肽,所述多肽優(yōu)選地 是重組體。
      [0020] 在第四個(gè)實(shí)施方案中,其也是第二個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案,通過全細(xì)胞催化 劑解決了所述問題,所述全細(xì)胞催化劑另外表達(dá)醇脫氫酶,所述醇脫氫酶優(yōu)選地為重組體。
      [0021] 在第五個(gè)實(shí)施方案中,其也是第一至第四個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案,通過全細(xì) 胞催化劑解決了所述問題,其中與所述全細(xì)胞催化劑的野生型相比,至少一種參與氧 化的酶的活性降低。
      [0022] 在第六個(gè)實(shí)施方案中,其也是第一至第五個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案,通過全細(xì) 胞催化劑解決了所述問題,其中與所述全細(xì)胞催化劑的野生型相比,BioH或其變體的活性 降低或增加。
      [0023] 在第七個(gè)實(shí)施方案中,其也是第一至第六個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案,通過全細(xì) 胞催化劑解決了所述問題,其中與所述全細(xì)胞催化劑的野生型相比,F(xiàn)adL或其變體的活性 增加。
      [0024] 在第二方面,通過一種用于將羧酸或二羧酸或其單酯轉(zhuǎn)化成胺或二胺的方法解決 了作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的問題,所述方法包括下述步驟: a) 提供羧酸或二羧酸或在二羧酸的情況下其單酯,優(yōu)選地通過使羧酸與烷烴羥化酶和 /或醇脫氫酶接觸, b) 使所述羧酸或二羧酸或其單酯與磷酸泛酰巰基乙胺基化的脂肪酸還原酶或α-雙 加氧酶接觸,形成醛產(chǎn)物,和 c) 使得自步驟a)的產(chǎn)物與轉(zhuǎn)氨酶接觸。
      [0025] 在第二方面中,一種方法解決了作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的問題,其中在步驟c)中,存 在氨基酸脫氫酶。
      [0026] 在第二方面的第一個(gè)實(shí)施方案中,通過一種方法解決了所述問題,其中將選自包 含磷酸泛酰巰基乙胺基化的脂肪酸還原酶、α -雙加氧酶、轉(zhuǎn)氨酶、氨基酸脫氫酶和烷烴羥 化酶的組的至少一種酶,優(yōu)選所使用的選自該組的所有酶,以全細(xì)胞催化劑的形式提供給 根據(jù)本發(fā)明的第一方面。
      [0027] 在第二個(gè)實(shí)施方案中,其也是第一個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案,通過一種方法解 決了所述問題,其中所述羧酸或二羧酸或其單酯是式(I)的化合物 R1 - A - COOR2 (I), 其中R1選自-H和COOR 3, 其中R2和R 3各自并彼此獨(dú)立地選自Η、甲基、乙基和丙基, 前提條件是,殘基R2和R3中的至少一個(gè)是Η, 其中A是無分支的、支鏈、直鏈、環(huán)狀、被取代的或未被取代的、具有至少4個(gè)碳原子的 烴基。
      [0028] 在第三個(gè)實(shí)施方案中,其也是第一至第二個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案,一種方法 解決了所述問題,其中A具有式-(CH2)n -,其中η是至少4,優(yōu)選至少10。
      [0029] 在第三方面,通過使用根據(jù)第一方面的全細(xì)胞催化劑或根據(jù)第二方面的方法用于 將脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、ω-氧代脂肪酸或其單酯胺化,解決了作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的問 題。
      [0030] 在第四方面,一種反應(yīng)混合物解決了作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的問題,所述反應(yīng)混合 物包含在水溶液中的根據(jù)第一方面的全細(xì)胞催化劑和式(I)的脂肪酸、ω-羥基脂肪酸、 ω-氧代脂肪酸或其單酯 R1-A- COOR2 (I), 其中 R1 選自-Η、-CH0、-OH 和 COOR 3, 其中R2和R 3各自并彼此獨(dú)立地選自Η、甲基、乙基和丙基, 前提條件是,殘基R2和R3中的至少一個(gè)是Η, 其中A是無分支的、支鏈、直鏈、環(huán)狀、被取代的或未被取代的、具有至少4個(gè)碳原子的 烴基,優(yōu)選式-(CH2)n -,其中η是至少4,特別優(yōu)選至少10。
      [0031] 本發(fā)明是基于發(fā)明人的以下認(rèn)識(shí):用于由脂肪酸生產(chǎn)胺和二胺且具有適當(dāng)酶配備 (Ausstattung)的全細(xì)胞催化劑中的功能重組的脂肪酸還原酶或α -雙加氧酶令人驚訝地 提高胺和二胺的產(chǎn)率。
      [0032] 此外,本發(fā)明是基于發(fā)明人的以下認(rèn)識(shí):用于由脂肪酸生產(chǎn)胺和二胺且具有適當(dāng) 酶配備的全細(xì)胞催化劑中的功能重組的脂肪酸還原酶或α-雙加氧酶令人驚訝地降低產(chǎn) 生的產(chǎn)物中的干擾性副產(chǎn)物(尤其是二羧酸及其酯形式的過度氧化的脂肪酸)的濃度。
      [0033] 此外,本發(fā)明是基于發(fā)明人的以下認(rèn)識(shí):用于由脂肪酸生產(chǎn)胺和二胺且具有適當(dāng) 酶配備的全細(xì)胞催化劑中的功能重組的脂肪酸還原酶或α-雙加氧酶改善液體陽離子交 換劑(諸如油酸)的純度和可重復(fù)使用性,所述液體陽離子交換劑用于從含有全細(xì)胞催化劑 的發(fā)酵溶液中除去胺和二胺。
      [0034] 本發(fā)明涉及改進(jìn)的將羧酸或二羧酸或其單酯轉(zhuǎn)化成胺或二胺的方法,所述方法的 特征在于,除催化脂肪酸經(jīng)由它的多個(gè)氧化階段轉(zhuǎn)化為胺的反應(yīng)的酶外,也存在脂肪酸還 原酶或α-雙加氧酶,優(yōu)選地,當(dāng)使用全細(xì)胞催化劑進(jìn)行所述方法時(shí)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方 案中,本文中使用的術(shù)語"脂肪酸還原酶"被理解為是指這樣的酶:其在消耗ATP和NAD (P) H的情況下催化ω-羧基酸(也被稱為二羧酸或ω-羧基脂肪酸)向相應(yīng)的ω-氧代脂肪酸 的轉(zhuǎn)化。在現(xiàn)有技術(shù)中,例如在W0/2010/135624中,描述了用于生產(chǎn)ω-羥基脂肪酸的脂 肪酸還原酶,但是并未作為生產(chǎn)ω-氨基脂肪酸的體系的一部分。在一個(gè)還更優(yōu)選的實(shí)施 方案中,所述脂肪酸還原酶選自含有以下氨基酸序列及其變體的脂肪酸還原酶: YP_887275. U ZP_11001941. U ZP_06852401. U NP_959974. U ΥΡ_001070587. U ΖΡ_05217435. 1、ΥΡ_882653. 1、ΥΡ_639435. 1、ΖΡ_10800193. 1、ΥΡ_006452763. 1、 ΥΡ_006730440. 1、ΖΡ_11196216. 1、ΥΡ_005349252. 1、ΖΡ_05224908. 1、ΥΡ_005338837. 1、 ΥΡ_006307000. 1、ΥΡ_005343991. 1、ΖΡ_11001942. 1、ΖΡ_09979565. 1、ΥΡ_005003162. 1、 ΥΡ_953393. 1、ΥΡ_001850422. 1、ΖΡ_11011489. 1、ΖΡ_12689264. 1、ΥΡ_905678. 1、 ΖΡ_09976919. 1、ΥΡ_004746059. 1、ΝΡ_217106. 1、ΥΡ_004525443. 1、ΝΡ_337166. 1、 ΖΡ_09685823. 1、ΥΡ_978699. 1、ΖΡ_06437984. 1、ΖΡ_06514086. 1、ΝΡ_856267. 1、CAA19077. 1、 ΝΡ_301424. 1、ΖΡ_06522140. 1、ΖΡ_06518098. 1、ΖΡ_11008938. 1、ΖΡ_07432374. 2、 AAR91681. 1、ΥΡ_006808747· 1、ΥΡ_001851230· 1、ΖΡ_15327751· 1、ΖΡ_15455857· 1、 ΖΡ_12874284. 1、ΖΡ_15332534. 1、ΖΡ_15512956. 1、ΖΡ_14244106. 1、ΖΡ_15470899. 1、 ΖΡ_11439367. 1、ΥΡ_001703694. 1、ΖΡ_15446742. 1、ΥΡ_006808978. 1、ΖΡ_07964926. 1、 ΥΡ_006521379. 1、ΖΡ_10796908. 1、ΖΡ_15512957. 1、ΖΡ_12874283. 1、ΥΡ_005350955. 1、 ΖΡ_14243341. 1、ΥΡ_001705436. 1、ΖΡ_15329649. 1、ΥΡ_006522325. 1、ΥΡ_006732197. 1、 ΥΡ_003658971. 1、ΖΡ_05227804. 1、ΥΡ_001703695. 1、ΥΡ_006308707. 1、ΖΡ_15342047. 1、 YP_006521380. 1、ZP_15327752. 1、YP_005340557. 1、ZP_11439578. 1、ZP_15392943. 1、 ZP_15514789. 1、ZP_12996178. 1、ZP_09412214. 1、ZP_06849686. 1、YP_889972. 1、 YP_006570321. 1、ZP_15375693. 1、YP_006308219. 1、YP_006521600. 1、YP_005340029. 1、 YP_005350457. 1、ZP_11439836. 1、ZP_12994664. 1、ZP_14240588. 1、ZP_14236860. 1、 ZP_09410830. 1、YP_006731697. 1、YP_005264225. 1、YP_001704097. 1、ZP_15328186. 1、 ZP_09402885. 1、ZP_12690463. 1、AF059871. 1、ZP_07966879. 1、YP_118225. 1、 YP_001828302. 1、YP_006566873. 1、YP_003660169. 1、ZP_15337407. 1、ZP_08240521. 1、 ZP_10456477. 1、YP_001537947. 1、YP_004016539. 1、ZP_07664024. 1、ZP_14244107. 1、 ZP_09794557. 1、ZP_09274211. 1、ZP_05224899. 1、ZP_15484175. 1、AAA17105. 1、 ZP_11437924. 1、ZP_15446621. 1、YP_003646340. 1、ZP_15382134. 1、ZP_14237669. 1、 ZP_09165547. U YP_004019203. U ZP_14240225. U YP_001220863. U CBA74242. U ZP_12994240. 1、EIE27140. 1、ZP_15354547. 1、ZP_15432557. 1、ZP_15500132. 1、 ZP_15478632. 1、ZP_06846978. 1、AAA17108. 1、ZP_15333767. 1、ZP_05217205. 1、 AAD44234. 1、YP_005348984. 1、YP_006306749. 1、ZP_05224611. 1、YP_005343772. 1、 YP_006730188. 1、YP_882425. 1、ZP_10799956. 1、ZP_05045132. 1、NP_960176. 1、 ZP_12398880. 1、ZP_11192735. 1、ZP_11440091. 1、ZP_05217203. 1、ZP_06846979. 1、 ZP_10800936. 1、ZP_06523596. 1、YP_882421. 1、YP_006306748. 1、YP_006522017. 1、 ZP_15432556. 1、ZP_15354095. 1、ZP_05227781. 1、ZP_09684639. 1、YP_006730187. 1、 YP_005343770. 1、YP_005338616. 1、YP_005348983. 1、ZP_15472813. 1、ZP_15457007. 1、 ZP_15421152. 1、ZP_15488933. 1、ZP_14240030. 1、YP_001704825. 1、ZP_15328982. 1、 YP_005911512. 1、ZP_09411638. 1、ZP_12876400. 1、ZP_12995435. 1、ZP_07667680. 1、 YP_001281387. 1、EIE21044. 1、ZP_15375054. 1、NP_334518. 1、4DQV_A、ZP_06435375. 1、 YP_003030020. 1、YP_976237. 1、ZP_04926822. 1、YP_004998149. 1、YP_004743589. 1、 YP_005907921. 1、NP_214615. 1、YP_001286047. 1、ZP_06515541. 1、ZP_05139482. 1、 YP_888016. 1、ZP_06452908. 1、ZP_06519578. 1、YP_004721827. 1、CAJ77696. 1、 ZP_09680854. 1、ZP_09686453. 1、YP_884815. 1、YP_884815. 1, CAB55600. 1、ZP_09081423. 1、YP_006521568. 1、ZP_11440626. 1、ZP_15513309. 1、 ZP_09410778. 1、ZP_15374248. 1、ZP_15405954. 1、YP_001704047. 1、ZP_1423691
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