序列及其變體的丙氨酸脫氫酶：得自枯草 芽孢桿菌（數(shù)據(jù)庫代碼L20916)、豌豆根瘤菌（數(shù)據(jù)庫代碼CP001622)、溶蛋白弧菌（數(shù) 據(jù)庫代碼AF070716)、結核分枝桿菌（數(shù)據(jù)庫代碼X63069)、產(chǎn)氣腸桿菌（數(shù)據(jù)庫代碼 AB013821)的丙氨酸脫氫酶的氨基酸序列，EGR93259. 1、YP_003654745. 1、YP_003651439. 1、 ΥΡ_003637111. 1、ΥΡ_003631815. 1、ΥΡ_001327051. 1、ΥΡ_001262560. 1、ΥΡ_886996. 1、 ΥΡ_882850. 1、ΥΡ_704410. 1、ΥΡ_703508. 1、ΖΡ_08624689. 1、ΥΡ_001230376. 1、Ρ17557. 1、 Ρ17556. 1、CCB94892. 1、CCB73698. 1、ΥΡ_001168635. 1、ΥΡ_004668736. 1、ΥΡ_004569425. 1、 ΥΡ_003513168· 1、ΥΡ_004561169· 1、ΖΡ_08554945· 1、ΥΡ_400777· 1、ΖΡ_08311476· 1、 ΖΡ_08310170. 1、ΖΡ_08267322. 1、ΖΡ_08263846. 1、ΖΡ_07898723. 1、ΥΡ_149301. 1、 ΥΡ_148605. 1、ΥΡ_004340432. 1、EFT09946. 1、EFS80513. 1、EFS51332. 1、EFS42459. 1、 ΥΡ_003060895. 1、ΥΡ_003059033. 1、ΖΡ_03305373. 1、ΥΡ_847214. 1、ΥΡ_004095847. 1、 ΥΡ_003338282. 1、ΥΡ_003337256. 1、ΥΡ_355846. 1、ΥΡ_253131. 1、ΖΡ_08197563. 1、 ΖΡ_08196283. 1、ADW06447. 1、ΥΡ_734091. 1、ΝΡ_372233. 1、ΝΡ_102173. 1、ΖΡ_08170259. 1、 EGD36706. 1、EGD32748. 1、ΖΡ_08155540. 1、ΥΡ_004142849. 1、ΥΡ_002417649. 1、 ΥΡ_001301040. 1、ΥΡ_002992892. 1、ΥΡ_081348. 1、ΥΡ_080482. 1、ΥΡ_002476349. 1、 ΖΡ_08115025. 1、ΖΡ_08114403. 1、ΥΡ_003552869. 1、ΥΡ_002358112. 1、ΥΡ_575010. 1、 ΥΡ_477594. 1、ΥΡ_474564. 1、ΥΡ_130399. 1、ΥΡ_129373. 1、ΥΡ_123314. 1、ΝΡ_810467. 1、 ΝΡ_646469· 1、ΝΡ_626044· 1、ΝΡ_391071· 1 (由 SEQ ID NO: 11 編碼）、ΖΡ_08086822· 1、 ΖΡ_08084776. 1、ΖΡ_08083119. 1、ΖΡ_08020768. 1、ΖΡ_08013590. 1、ΖΡ_08011832. 1、 ΥΡ_003783744. 1、ΥΡ_002781576. 1、ΥΡ_002780533. 1、ΖΡ_02195873. 1、ΝΡ_797482. 1、 ΖΡ_07645051. 1、ΖΡ_07643260. 1、ΖΡ_06611917. 1、ΑΑΤ40119. 1、ΖΡ_07864946. 1、 ΥΡ_004068409. U ΥΡ_002796203. U ΥΡ_002774420. U ΥΡ_003600348. U ΥΡ_003599946. U ΥΡ_003565624. 1、ΥΡ_003565223. 1、ΥΡ_335198. 1、ΥΡ_423850. 1、ΥΡ_155059. 1、 ΖΡ_07843538. 1、ΖΡ_07841226. 1、ΖΡ_06928932. 1、ΖΡ_05692073. 1、ΖΡ_05687006. 1、 ΖΡ_04867480· 1、ΥΡ_775531· 1、CBE70214. 1、ΖΡ_07721182· 1、ΖΡ_04302850· 1、 ΖΡ_04298961. 1、ZPJM287684. 1、ZPJM277177. 1、ΖΡ_04248389. 1、ZPJM235899. 1、 ΖΡ_02159718· 1、ΖΡ_02152178· 1、ΥΡ_003974610· 1、ΥΡ_003546595· 1、ΥΡ_002317127· 1、 ZP_07313778. U ZP_07302778. U ZP_07298850. U CBK69442. U YP_003413835. U YP_003595089. 1、ZP_06807811. 1、YP_003582455. 1、YP_003464731. 1、YP_003496397. 1、 YP_003421918. 1、CBL07274. 1、CBK64956. 1、YP_003508515. 1、AAL87460. 1、AAC23579. 1、 AAC23578. 1、AAC23577. 1、ACU78652. 1、YP_003471439. 1、YP_003452777. 1、ZP_06384971. 1、 ACY25368. 1、ABC26869. 1、AAP44334. 1、EEZ80018. 1、ZP_05110458. 1、1PJB_A、 ZP_04717201. 1、ZP_04689103. 1、CA090307. 1、CAM75354. 1、CAA44791. 1、BAA77513. 1、 EGR96638. 1、EGL90046. 1、YP_004510847. 1、ZP_08450330. 1、YP_003387804. 1、 YP_003058152. 1、EFS74272. 1、EFS67128. 1、ZP_06844564. 1、YP_826658. 1、 YP_001195249. 1、YP_003095978. 1、YP_469292. 1、YP_004442054. 1、YP_004461174. 1、 YP_004055616. 1、YP_003576656. 1、YP_003094537. 1、YP_001295973. 1、AEE71143. 1、 YP_004447480. 1、YP_003761844. 1、YP_040853. 1、YP_003154888. 1、YP_003142045. 1、 YP_002280953. 1、NP_371963. 1、NP_422368. 1、EGC98966. 1、EGC76398. 1、YP_004263661. 1、 YP_004252039. U YP_679036. U YP_499973. U ZP_08054972. U ZP_08053009. U ZP_04067276. 1、ZP_03968868. 1、ZP_03963857. 1、ZP_03933079. 1、ZP_03497046. 1、 ZP_06668924. 1、ZP_06667106. 1、ZP_06324464. 1、ZP_06196777. 1、ZP_05114159. 1、 ZP_05083968. U ZP_05070370. U ZP_05030022. U ZP_04673064. U ZP_03517011. U ZP_03505783. 1、XP_001310698. 1、ABK27691. I 和 CAB59281. 2。對于由丙氨酸脫氫酶催化的 反應，不僅需要存在丙酮酸鹽(其形成為適合作為全細胞催化劑的任何細胞的初級代謝的 一部分)，而且也需要存在銨。后者通常以無機氮鹽的形式提供，例如銨鹽、硝酸鹽等。優(yōu)選 地，將銨鹽(例如氯化銨）加入水性反應介質中。
[0041] 此外，當根據(jù)本發(fā)明的全細胞催化劑表達烷烴羥化酶和任選的對于烷烴羥化酶的 活性而言所必需的其它酶時是有利的，尤其是對于下述情況而言：使用僅具有一個末端羧 基官能團的脂肪酸作為生產(chǎn)二胺的底物。然后，烷烴羥化酶和/或額外表達的醇脫氫酶氧 化末端碳原子直至為醛基，所述醛基隨后可以被轉氨酶胺化，或氧化為羧基，所述羧基被 α-雙加氧酶或由脂肪酸還原酶和磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶構成的組合轉化為末端醛 基，所述醛基隨后可以被轉氨酶胺化。在一個優(yōu)選的實施方案中，本文中使用的術語"烷烴 羥化酶"被理解為是指這樣的酶：其催化未被取代的含有至少6個、優(yōu)選12個碳原子的直 鏈烷基殘基的羥基化。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明，眾多氧化體系(尤其如在PCT/EP 2008/067447中所述的)適合作為烷 烴羥化酶。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述烷烴羥化酶是CYP153家族的細胞色素 Ρ450單加 氧酶。在一個優(yōu)選的實施方案中，術語"CYP153家族的細胞色素 Ρ450單加氧酶"被理解為 是指這樣的細胞溶質氧化酶：其是另外含有鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶的3-組分體 系的一部分，具有烷烴結合位點和將烷烴羥基化的能力。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，它 是：與得自Wcaflirarar SK2的CYP153家族的細胞色素 Ρ450單加氧酶（數(shù) 據(jù)庫代碼ΥΡ_691921)具有至少80%、優(yōu)選90%、最優(yōu)選95%或99 %序列同一性的酶，或者 是含有一種多肽序列且另外具有烷烴羥化酶活性的酶，所述多肽序列與得自 辦or辦tfseasis SK2的CYP153家族的細胞色素 P450單加氧酶（數(shù)據(jù)庫代碼YP_691921)具有 至少80%、優(yōu)選90%、最優(yōu)選95%或99 %序列同一性。如貫穿本申請的，所述數(shù)據(jù)庫代碼在 這里是指基于NCBI (國家生物技術信息中心，Bethesda，USA)的數(shù)據(jù)庫，更精確講，2012 年11月21日可在線獲得的版本。在一個優(yōu)選的實施方案中，術語"CYP153家族的細胞色 素 P450單加氧酶"被理解為是指非膜結合的氧化酶，其包括用于烷烴、未被取代的直鏈烷 基殘基(包括至少5個、優(yōu)選12個碳原子）或單羥基化的烷烴的結合位點，且其多肽鏈含有 基序LL(I/L) (V/I)GGNDTTRN。在一個優(yōu)選的實施方案中，本文中使用的"CYP153家族的細 胞色素 P450單加氧酶"是得自Wcaflirarar SK2的CYP153家族的細胞色素 P450單加氧酶（數(shù)據(jù)庫代碼YP_691921)或其變體，其優(yōu)選地具有烷烴羥化酶活性。
[0043] 為了給CYP153家族的細胞色素 Ρ450單加氧酶最佳地供給來自還原劑(優(yōu)選NADH) 的電子，優(yōu)選的是，所述細胞表達烷烴羥化酶以及在功能上與它相互作用的鐵氧還蛋白還 原酶和在功能上與它相互作用的鐵氧還蛋白。這些可以是分離的多肽，或在使用全細胞催 化劑的情況下，是共表達的多肽，或是在N-或C-端與CYP153家族的細胞色素 Ρ450單加氧 酶融合的多肽。本領域技術人員可以如下容易地確定鐵氧還蛋白還原酶或鐵氧還蛋白與給 定的CYP153家族的細胞色素 Ρ450單加氧酶是否在功能上彼此相互作用：與缺少所述3種 物質中的至少一種的情況相比，在有烷烴底物和所述3種多肽存在下是否會更有效地氧化 還原劑?；蛘呖梢允褂?Scheps, D·，Malca, Η·，Hoffmann, Β·，Nestl, Β. Μ,和 Hauer, B. (2011) Cr盡份9，6727描述的酶試驗，在功能上相互作用的多肽的情況 中，該試驗顯示出反應速率的顯著增加。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，CYP153家族的細 胞色素 Ρ450單加氧酶、鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶源自相同生物體。在一個特別優(yōu)選 的實施方案中，它們是得自SK2的鐵氧還蛋白還原酶（數(shù)據(jù)庫 代碼YP_691923)或其變體、得自SK2的鐵氧還蛋白（數(shù)據(jù)庫代 碼YP_691920)或其變體、和得自J/caflirarar Aor辦SK2的CYP153家族的細胞色 素 Ρ450單加氧酶（數(shù)據(jù)庫代碼ΥΡ_691921)或其變體。
[0044] 在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述烷烴羥化酶是AlkB單加氧酶。AlkB是首先從 得自惡臭假單胞菌Gpol的AlkBGT體系已知的氧化還原酶，其依賴于另外2種多肽AlkG和 AlkT。AlkT被表征為FAD依賴性的紅素氧還蛋白還原酶，其將電子從NADH傳遞至AlkG。 AlkG是一種紅素氧還蛋白（含鐵的氧化還原蛋白），其作為AlkB的直接電子供體起作用。在 一個優(yōu)選的實施方案中，術語"AlkB單加氧酶"是這樣的多肽：其與;單邀磨Gpol的 AlkB的序列（數(shù)據(jù)庫代碼：CAB54050. 1 ;象在本申請中使用的所有其它數(shù)據(jù)庫代碼一樣， 該數(shù)據(jù)庫代碼源自現(xiàn)有技術，即源自NCBI數(shù)據(jù)庫，更精確講，在2012年10月15日可在線得 到的版本）具有至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或99%的序列同源性(按照遞增 優(yōu)選次序給出)，且具有氧化烷烴的能力。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述AlkB單加氧 酶是氧化烷烴的氧化還原酶，其在功能上與得自惡臭假單胞菌Gpol的AlkG (CAB54052. 1) 和AlkT (CAB54063. 1)多肽相互作用。為了給AlkB烷烴羥化酶最佳地供給電子，優(yōu)選的是， 所述細胞表達單加氧酶以及在功能上與它相互作用的輔助蛋白，優(yōu)選AlkG和/或AlkT或 它們各自的變體，其中在一個特別優(yōu)選的實施方案中，這些再次是得自惡臭假單胞菌Gpol 的 AlkG (CAB54052.1)和 AlkT (CAB54063.1)多肽。
[0045] 在全細胞催化劑的使用中，問題可以源自：必須使底物與位于細胞內(nèi)的酶接觸， 從而發(fā)生期望的反應。在長鏈烷烴及其衍生物的情況下，優(yōu)選的是，全細胞催化劑含有 AlkL家族的多肽。AlkL是得自惡臭假單胞菌的膜蛋白，其可以將長鏈脂肪酸及其衍生 物輸入細菌細胞中。在一個優(yōu)選的實施方案中，本文中使用的"AlkL家族的多肽"是這 樣的多肽：其在230個連續(xù)氨基酸的長度上與得自惡臭假單胞菌的AlkL (數(shù)據(jù)庫代碼 CAB69081)或得自惡臭假單胞菌的AlkL的變體具有至少80%、優(yōu)選90%、更優(yōu)選90%的序 列同一性，且優(yōu)選地具有促進長鏈烷烴向細胞內(nèi)部輸入的能力。在另一個實施方案中， 本文中使用的"AlkL家族的多肽"是位于革蘭氏陰性細菌的外膜中的多肽，其具有序列 基序DXWAPAXQ(V/A)GXR，其中X代表形成蛋白的氨基酸，且優(yōu)選地另外是得自惡臭假單 胞菌的AlkL (數(shù)據(jù)庫代碼CAB69081)或其變體。AlkL家族的成員的例子包括得自惡臭 假單胞菌（數(shù)據(jù)庫代碼CAB69081)、水油海桿菌（iferifloAacier aijttaeo/ei) VT8 (數(shù)據(jù) 庫代碼 YP_957722)、HTCC2633 (數(shù)據(jù)庫代碼 ZP_00953584)、 iferifloAacier MnI7_9 (數(shù)據(jù)庫代碼 ZP_09158756)、柄桿菌 K31 (數(shù)據(jù)庫 代碼 YP_001672217)、食油假單胞菌o/eorarafls)(數(shù)據(jù)庫代碼 Q00595)的 AlkL及其變體。
[0046] 本發(fā)明的教導不僅可以使用具有精確氨基酸或核酸序列的大分子(在本文中引 用）來實現(xiàn)，或者不僅可以使用相對于各自的野生型具有降低的帶精確氨基酸序列的多肽 活性的細胞(在本文中引用）來實現(xiàn)，而且可以使用這樣的大分子的變體、或與各個細胞的 各自的野生型相比具有降低的多肽變體活性的細胞(其可以通過一個或超過一個氨基酸或 核酸的刪除、添加或置換而得到）來實現(xiàn)。在一個優(yōu)選的實施方案中，本文中使用的術語核 酸序列或氨基酸序列的"變體"（在下面與術語"同系物"等效地且可交換地使用）是指另一 種核酸或氨基酸序列，其包括或者是這樣的序列：其相對于相應的原始野生型核酸-或氨 基酸序列，具有70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或更高百分比的同源性（在 這里與同一性等效使用)，其中優(yōu)選地，除了形成催化活性中心的氨基酸或者為結構或折疊 所必需的那些氨基酸以外的氨基酸被刪除或置換，或者它們僅僅被保守地置換，例如用谷 氨酸替換天冬氨酸，或用亮氨酸替換纈氨酸?，F(xiàn)有技術描述了可以用于計算2個序列的同 源性程度的算法，例如Arthur Lesk (2008)，Introduction to Bioinformatics,第 3 版。 在本發(fā)明的另一個更優(yōu)選的實施方案中，優(yōu)選地除了前述序列同源性以外，氨基酸-或核 酸序列的變體基本上具有與野生型分子或原始分子相同的酶活性。例如，作為蛋白酶的酶 活性多肽的變體具有與該多肽酶相同的或基本上相同的蛋白水解活性，即催化肽鍵水解的 能力。在一個特殊的實施方案中，術語"基本上相同的酶活性"是指，關于野生型多肽的底 物的活性，其明顯高于背景活性，或/和與野生型多肽關于相同底物表現(xiàn)出的Km和/或k 值相差小于3個、更優(yōu)選2個、還更優(yōu)選1個數(shù)量級。在另一個優(yōu)選的實施方案中，術語核 酸-或氨基酸序列的"變體"包含所述核酸-或氨基酸序列的至少一個活性部分或片段。在 另一個優(yōu)選的實施方案中，本文中使用的術語"活性部分"是指這樣的氨基酸序列或核酸序 列：其具有比全長氨基酸序列更小的氨基酸序列或編碼比全長氨基酸序列更小的氨基酸序 列，其中具有比野生型氨基酸序列更小長度的氨基酸序列或編碼的氨基酸序列具有與野生 型多肽或其變體(例如蛋白酶）基本上相同的酶活性。在一個具體實施方案中，術語核酸的 "變體"包括這樣的核酸：其互補鏈結合野生型核酸，優(yōu)選地在嚴謹條件下。對于本領域技 術人員而言，雜交反應的嚴謹性是容易確定的，且通常取決于探針的長度、洗滌溫度和鹽濃 度。一般而言，較長的探針需要較高的雜交溫度，而較短的探針與較低溫度一起使用。雜交 是否發(fā)生，通常取決于變性的DNA與在它們附近存在的互補鏈退火的能力，更確切地說在 解鏈溫度以下。雜交反應的嚴謹性和相應的條件更詳細地描述在：F. M. Ausubel (1995)， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.。借助雜交鑒別DNA 序列的說明本領域技術人員尤其可見于Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim,德國， 1993)的手冊"The DIG system User's Guide for Filter Hybridization"中和在 Liebl 等人（International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991))中。 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述雜交在嚴謹條件下進行，也就是說，僅形成這樣的雜交體： 其中探針和靶序列（即用探針處理的多核苷酸）具有至少70%同一性。已知的是，緩沖液組 成、溫度和鹽濃度的變化會影響和/或決定包括洗滌步驟的雜交的嚴謹性。一般而言，與洗 絳步驟相比，在相對低的嚴謹性下進行雜交反應（Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington，UK, 1996)。例如，在約 50°C-68°C的溫度下，可以使用與 5xSSC 緩沖液相應的緩沖液用于雜交反應。在此，探針還可以與這樣的多核苷酸雜交：所述多核 苷酸與所述探針的序列具有小于70%的同一性。這樣的雜交體具有更低的穩(wěn)定性，并且通 過在嚴謹條件下的洗滌來除去。這可以例如如下實現(xiàn)：通過將鹽濃度降低至2x SSC，和任 選地隨后降低至 〇.5x SSC (The