DIG System User's Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim,曼海姆，德國，1995)，其中按照遞增優(yōu)選次序，建立約50°C_ 68°C、約 52°C - 68°C、約 54°C - 68°C、約 56°C - 68°C、約 58°C - 68°C、約 60°C - 68°C、約 62°C - 68°C、約 64°C - 68°C、約 66°C - 68°C 的溫度。約 64°C -68°C 或約 66°C -68°C 的溫度 范圍是優(yōu)選的。任選地還可以將鹽濃度降低至與〇.2x SSC或0.1 x SSC相應的濃度。通過 使雜交溫度以約1_2°C的步長從50°C逐步升高至68°C，可以分離這樣的多核苷酸片段：例 如，按照遞增優(yōu)選次序，其與使用的核酸分子的序列具有至少70%、或至少80%、或至少90%、 至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99% 的同一性。關于雜交的其它說明，可以在市場上以所謂的試劑盒（例如DIG Easy Hyb，得自 公司Roche Diagnostics GmbH,曼海姆，德國，目錄號1603558)的形式得到。在一個優(yōu) 選的實施方案中，本文中使用的術語核酸的"變體"包括這樣的任意核酸序列：其在遺傳密 碼簡并性的范圍內，編碼與原始核酸相同的氨基酸序列或該氨基酸序列的變體。
[0047] 在一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的細胞具有與其野生型相比至少一種 酶的活性降低，所述酶催化脂肪酸的氧化反應之一，其中這優(yōu)選地為選自以下的酶：月旨 肪酸輔酶A連接酶、?；o酶A脫氫酶、2, 4-二烯酰輔酶A還原酶、烯酰輔酶A水合酶和 3-酮酰基輔酶A硫解酶、脂肪酸輸入酶（Fettsjiureimporter)或其變體。脂肪酸的β-氧 化是普遍的代謝途徑，其同樣允許原核和真核生物氧化脂肪酸和使得其中所含的化學能可 用于代謝。在更寬的含義上，它從將脂肪酸攝取到細胞中開始。在那里，只要條件需要它，在 大腸桿菌FadE的情況下，脂肪酸首先在輔酶A脂肪酸酯的β位置處被?；o酶A脫氫酶氧 化?；蛘撸诖竽c桿菌FadH中，通過借助2, 4-二烯酰輔酶A還原酶的還原，還可以從雙不 飽和脂肪酸形成類似的分子。在大腸桿菌FadB中，多功能的酶，烯酰輔酶A水合酶/3-羥 基?；o酶A脫氫酶，然后催化水合，形成仲醇，隨后將它氧化為酮。在最后一步中，在大腸 桿菌FadA的情況下，3-酮?；o酶A硫解酶催化酮酰基輔酶A的裂解，結果是，釋放出乙 酰輔酶A和與起始分子相比縮短了 2個碳原子的脂肪酸的輔酶A酯。如果它也不是乙酰輔 酶Α，則可以將后者重新送入β氧化循環(huán)，并通過氧化而縮短。FadR也參與脂肪酸的β氧 化的調節(jié)，F(xiàn)ad操縱子的調芐基因，所述Fad操縱子包含脂肪酸的降解所必需的基因，但是 FadR不會催化β氧化反應。在一個優(yōu)選的實施方案中，術語"催化脂肪酸的β氧化反應 之一的酶"被理解為是指這樣的所有酶：其與脂肪酸底物或在通向乙酰輔酶A的途徑上的 從所述脂肪酸底物形成的分子直接相互作用，優(yōu)選地將它識別為底物，并催化它轉化為在 該降解途徑上更接近乙酰輔酶A的代謝產物，優(yōu)選地包括實現(xiàn)將脂肪酸攝取到細胞中的脂 肪酸輸入酶。例如，根據(jù)上述定義，這些酶包括酰基輔酶A脫氫酶，因為它與脂肪酸輔酶A 酯相互作用，并催化它向烯酰輔酶A的轉化，所述烯酰輔酶A在β氧化的代謝途徑上比脂 肪酸輔酶A酯更接近乙酰輔酶Α。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本文中使用的術語"催化 脂肪酸的β氧化反應之一的酶"被理解為是指這樣的任意酶：其選自得自大腸桿菌的基因 產物FadA、FadB、FadD、FadL和FadE，和/或它們的變體或得自其它生物體的同系物。得 自大腸桿菌的基因產物FadA、FadB、FadD、FadL和FadE，以及變體和許多其它生物技術上 有用的生物體的同系物，和它們的核酸-和多肽序列，被描述在現(xiàn)有技術中，例如在登錄號 AP009048. 1下的FadA、在登錄號BAE77457. 1下的FadB、在登錄號BAA15609. 1下的FadD、和 在登錄號BAA77891. 2下的FadE?，F(xiàn)有技術公開了許多特別適合用于測量酶的活性的試驗， 所述酶催化脂肪酸的β氧化反應之一，例如在下述文獻中：K Kameda & W D Nunn (1981) J. Biol. Chem. 256, 5702-5707, Hi Marrakchi, W E Deffolf, C Quinn, J West, B J ?〇11221，〇￥5〇等人（2003)81〇。1^111.丄 370，1055-1062，1^13〇等>1「2001)和父￥11， T Liu, F Zhu，和C Khosla (2011) PNAS，印刷前的電子出版物。
[0048] 就根據(jù)本發(fā)明的全細胞催化劑的效率而言，有利的是，要轉化的底物、優(yōu)選羧酸或 二羧酸或其單酯可以容易地接觸根據(jù)本發(fā)明必需的酶，所述酶位于全細胞催化劑的內部。 因此，至關重要的是，所述底物可以到達細胞的內部。為了使其變得容易，優(yōu)選的是，在細 菌、尤其是革蘭氏陰性全細胞催化劑的情況下，所述全細胞催化劑表達脂肪酸輸入酶，特別 優(yōu)選脂肪酸輸入酶FadL (數(shù)據(jù)庫代碼：BAA16205. 1)或變體，優(yōu)選地以濃度和活性與相 應的全細胞催化劑的野生型的活性相比增加。通過本領域技術人員常規(guī)地可接近的多種途 徑，可以實現(xiàn)多肽活性與細胞的野生型相比的增加，所述途徑例如：摻入在功能上與啟動子 連接的編碼多肽的核苷酸序列的額外拷貝，或將天然啟動子置換為更強的啟動子。
[0049] 已經表明，根據(jù)本發(fā)明，在下述情況下，以更高產率和純度生產胺和二胺：優(yōu)化在 全細胞催化劑中內源性地表達的酶的背景，從而降低或關閉內源酶的活性，所述內源酶在 代謝途徑中降解根據(jù)本發(fā)明的方法或使用根據(jù)本發(fā)明的細胞的反應物、中間產物或產物 (優(yōu)選ω-氨基羧酸、ω-羥基羧酸、ω-氧代羧酸和二羧酸的甲酯)，或者以偏離期望產物的 形成的其它方式修飾它們。在該背景下，可能有利的是，根據(jù)本發(fā)明的全細胞催化劑是這樣 的細胞，其具有與它的野生型相比降低的酯酶BioH [數(shù)據(jù)庫代碼ΥΡ_492020. 1]或其變體 的活性。這樣的具有降低的BioH活性的細胞、它們的生產和活性確定試驗描述于歐洲專利 申請 ΕΡ12007663. 3 中。
[0050] 對于化合物的混合物作為使用羧酸、二羧酸或其單酯的情況，在所述化合物中，末 端羧基以高程度存在，優(yōu)選地至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%以酯的形式存在，例如 因為這些底物的更好可用性或游離羧酸或二羧酸的毒性，所述單酯可以通過完全酯化的二 羧酸的部分或完全水解來提供，且所述游離羧酸通過完全酯化的羧酸的部分或完全水解來 提供。對于該情況有利的是，通過合適的酯酶的過表達來增加細胞對酯水解的能力。為此， 在一個優(yōu)選的實施方案中，酯水解酶BioH或其變體的活性與使用的全細胞催化劑的野生 型相比增加，特別優(yōu)選地通過過表達。然后通過酯水解原位提供相應的單酯和/或未酯化 的羧酸或二羧酸。還可以通過化學催化的水解，例如在低pH值下，實現(xiàn)完全酯化的二羧酸 的部分或完全水解。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明的全細胞催化劑可以優(yōu)選地用在將羧酸或二羧酸或其單酯轉化成對 應胺或二胺的方法中，其中所述羧酸或二羧酸或其單酯是式（I)的化合物 R1 - A - COOR2 (I)， 其中R1選自-H和COOR 3,其中R2和R 3各自并彼此獨立地選自H、甲基、乙基和丙基，前 提條件是，殘基R2和R3中的至少一個是H，其中A是無分支的、支鏈、直鏈、環(huán)狀、被取代的或 未被取代的、具有至少4個碳原子的烴基。在一個優(yōu)選的實施方案中，A是式-(CH2)n-的結 構，其中 η 優(yōu)選地是 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29或30。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述羧酸或二羧酸是月桂酸或〇-羧基月 桂酸。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，所述羧酸是式CH3- (CH2) n-C00H的羧酸，其中η優(yōu)選地 是 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30,優(yōu)選是己酸或癸酸。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，所述羧酸或二羧酸是式HOOC- (CH2)n-C00H 的二羧酸，其中 η 優(yōu)選地是 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29或30，優(yōu)選是〇-羧基己酸或〇-羧基癸酸。在另一個最優(yōu)選 的實施方案中，所述羧酸或二羧酸是ω-羧基十四烷酸。因此，根據(jù)本發(fā)明生產的胺或二胺 優(yōu)選地是式CH3- (CH2) "-順2或NH 2- (CH2) η-ΝΗ2的化合物，其中η在每種情況下優(yōu)選地是4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30。
[0052] 關于羧酸或二羧酸或其單酯和關于在本申請中描述的任意化學化合物，所述的各 個式包括各種化合物的所有鹽(質子化的或去質子化的)。例如，月桂酸不僅包括質子化形 式，而且包括具有所有陽離子的月桂酸鹽，例如月桂酸鈉。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明的方法要求，在水溶液中使根據(jù)本發(fā)明的方法使用的酶(任選地，以根 據(jù)本發(fā)明的全細胞催化劑的形式提供）與羧酸或二羧酸或其單酯接觸。在一個優(yōu)選的實施 方案中，本文中使用的術語"接觸"被理解為是指，各自的酶與它的底物直接接觸，尤其是在 二者之間沒有插入物理屏障諸如不透性膜等。在最簡單的情況下，通過將底物加入酶或全 細胞催化劑所在的水溶液中來進行所述接觸。
[0054] 適合用于實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的教導的是這樣的反應混合物，其包含水溶液中的根據(jù) 本發(fā)明的全細胞催化劑8和式（I)的羧酸或二羧酸或其單酯，其中R1選自-H COOR 3,其中 R2和R3各自并彼此獨立地選自Η、甲基、乙基和丙基，前提條件是，殘基R2和R 3中的至少一 個是Η，其中A是無分支的、支鏈、直鏈、環(huán)狀、被取代的或未被取代的、具有至少4個碳的烴 基，優(yōu)選式-(CH2)n -，其中η是至少4,特別優(yōu)選至少10。這里的水溶液例如就組成、pH 和溫度而言，必須構造成使得所述溶液促進全細胞催化劑的生存力或至少催化能力至少一 定時間。本領域技術人員已知許多適合作為水溶液的水性培養(yǎng)基，它們適合用于維持或培 養(yǎng)細胞，尤其是在生物技術上重要的細胞。這些同樣包括完全培養(yǎng)基諸如LB培養(yǎng)基、基本 培養(yǎng)基諸如M9培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng)基，例如含有高鹽濃度且因此僅允許嗜鹽的或至少耐 鹽的生物體的生長的那些。在一個優(yōu)選的實施方案中，本文中使用的術語"水性培養(yǎng)基"被 理解為是指基于水的反應介質，其就所有有關的因素(尤其是PH、鹽含量和溫度）而言，被 構造成使得它會維持或促進其中所含的細胞(優(yōu)選微生物）的生存力，并且水性培養(yǎng)基以及 疏水有機相都以液體形式存在。從微生物學和分子生物學教科書(例如Fuchs/Schlegel, 2008)，可以知悉不同的在生物技術上重要的細胞的溫度需求。在一個優(yōu)選的實施方案中， 在接觸時，水性培養(yǎng)基的pH值在4-9之間，更優(yōu)選在4. 5至8. 5之間，最優(yōu)選在6. 5至7. 5 之間。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述溫度是在〇_45°C之間，更優(yōu)選15-40?之間，最優(yōu) 選在20-37?之間。所述反應混合物通常含于發(fā)酵罐中。可以被滅菌(優(yōu)選高壓滅菌)并允 許培養(yǎng)全細胞催化劑、通氣和控制反應條件(例如氧含量和溫度）的任何反應容器可以充當 發(fā)酵罐。
[0055] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述反應混合物除了包括水溶液以外還包括疏水有機 相。這可以包含有機溶劑和/或疏水液體陽離子交換劑，所述陽離子交換劑用于從水溶液 中除去ω-氨基脂肪酸。合適的溶劑和陽離子交換劑描述于EP11191520.3中。
[0056] 此外，通過下述附圖和非限制性實施例更具體地描述了本發(fā)明，從其中可以推知 本發(fā)明的其它特征、實施方案、方面和優(yōu)點。
[0057] 圖 I :21· 75 h 處理時間以后，菌株犬廢//磨 W3110 pACYC{Placuv5} [carA_ Ms-npt_N0C]/pJ281_alaDH_B. s._TA_C.v· (ct)的發(fā)酵液中的單胺和二胺的檢測。
[0058] 實施例1 生產用于表達得自恥垢分枝桿菌的基因 MSMEG_2956和 得自諾卡氏菌屬（Abcart/ia 5/7.)的基因的表達載體 為了生產用于共表達得自恥垢分枝桿菌的編碼脂肪酸還原酶（ΥΡ_887275. 1)的 MSMEG_2956 (carA，SEQIDNo. 1)和得自諾卡氏菌屬的編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶 (ABI83656.1)(其將脂肪酸還原酶磷酸泛酰巰基乙胺化）的(SEQ ID No. 2)的載體， 借助于PCR擴增兩個基因，插入用于重組克隆的同源區(qū)域。在這方面，供體生物體的用于擴 增基因 MSMEG_2956的基因組DNA和用于擴增基因的合成DNA片段充當模板。所述基 因是在lacuv5啟動子（SEQ ID No. 3)的控制下，其同樣借助于PCR從現(xiàn)有的載體起始進 行擴增，插入用于重組克隆的同源區(qū)域。
[0059] 在這方面，使用以下寡核苷酸： Plac_Hl_fw: 5 '-TTATGCGACTCCTGCTGGCTATGGTGGGATTTCC-3 '（SEQ ID Nr. 4) Plac_H2_rv: 5 '-GATCGTCATATGCCACTCTCCTTGGTTCC-3 '（SEQ ID Nn 5) carA_H2_fw: 5 '-TGGCATATGACGATCGAAACGCGCG-3 '（SEQ ID Nr. 6) carA_H3_rv: 5 '-TCCTTCTCTTACAGCAATCCGAGCATCT-3 '（SEQ ID Nr. 7) npt_H3_fw: 5 '-GCTGTAAGAGAAGGAGTTCTATCATGATCGAG-3 '（SEQ ID Nr. 8) npt_H4_rv: 5 '-GCAGCCTAGGTTAATTTATCAGGCGTACGCGATCG-3 '（SEQ ID Nr. 9)。
[0060] 將下述參數(shù)用于擴增Plaeuv5和基因的PCR :1 X :最初變性，98°C，0:30 min ;35 x :變性，98°C，0:10 min，退火，55°C，0:20 min ;延伸，72°C，0:15 min ;1 x :末端延伸，72°C， 10 min。為了擴增基因 MSMEG_2956,使用以下參數(shù)：1 x:最初變性，98°C，0:30 min;35 x:變 性，98°C，0:10 min，退火，65°C，0:20 min;延伸，72°C，1 min;l X:末端延伸，72°C，10 min。 為了擴增，根據(jù)生產商的推薦，使用得自New England Biolabs (Frankfurt)的Phusion? High-Fidelity Master Mix。在每種情況下，然后在1%濃度的TAE瓊脂糖凝膠上拆分5〇μ1 PCR反應物。以本領域技術人員已知的方式進行PCR、瓊脂糖凝膠電泳、DNA的溴化乙錠染 色和PCR片段大小的確定。在所有情況下，可以擴增預期大小的PCR片段。這些對于Plarav5而言為325個堿基對，對于MSMEG_2956而言為3. 5千堿基對，且對于耶?而言為718個堿 基對。為了從瓊脂糖凝膠分離DNA，使用解剖刀從凝膠切出靶DNA，并根據(jù)生產商（Qiagen， Hilden)的說明書使用必/icA 6?/提取試劑盒純化。根據(jù)生產商（Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)的說明書，使用Geneart?無縫克隆和裝配試劑盒通過重組將純化的 PCR 產物克隆進 AcoNI-和切割的 pACYCDuet-1 載體（Merck, Darmstadt)中。以 本領域技術人員已知的方式，轉化化學感受態(tài)的大腸桿菌DHlO β (New England Biolabs, Frankfurt)。通過限制性分析檢查靶基因的正確插入，并通過DNA測序證實插入的基因的 真實性。完成的表達載體被稱作pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc](SEQIDNo·10)。
[0061] 實施例2 生產用于共表達得自枯草芽孢桿菌的基因 aid和得自紫色色桿 菌（CXroffioAacteritt? Fio/ace腫）的基因02025的表達載體 為了生產得自枯草芽孢桿菌的編碼丙氨酸脫氫酶（NP_39107L1)的基因 W (SEQ ID No. 11)和得自紫色色桿菌的編碼轉氨酶（NP_901695. 1)的CV_激W (SEQ ID No. 12)的大腸桿菌表達載體，將得自枯草芽孢桿菌的基因 aid (替代得自球形芽孢桿菌的 基因 aA/)克隆進大腸桿菌表達載體pJ281_alaD_Bsp_TA_C. V. (ct)(序列和生產，參見 W0/2013/024114中的實施例1和其中列出的SEQ ID No. 17)中。通過PCR從得自枯草芽 孢桿菌菌株168的染色體DNA擴增得自枯草芽孢桿菌的基因 W。在這方面，使用以下的寡 核苷酸： alaDH_pCR22_fw: 5' -ATGATCATAGGGGTTCCTAAAGAG-3' (SEQ ID No. 13) alaDH_pCR22_rev: 5' -TTAAGCACCCGCCACAGATG-3' (SEQ ID No. 14)。
[0062] 將下述參數(shù)用于PCR :1 x :最初變性，98°C，0:30 min ;35 x :變性，98°C，0:10 min， 退火，65°C，0:30 min;延伸，72°C，0:20 min;l x:末端延伸，72°C，10 min。為了擴增，根據(jù) 生產商的推薦，使用得自 New England Biolabs (Frankfurt)的 Phusion? High-Fidelity Master Mix。在每種情況下，然后在1%濃度的TAE瓊脂糖凝膠上拆分5〇μ1 PCR反應物。 以本領域技術人員已知的方式進行PCR、瓊脂糖凝膠電泳、DNA的溴化乙錠染色和PCR片段 大小的確定。PCR片段顯示1137個堿基對的預期大小，且根據(jù)得自生產商的信息使用得自 Qiagen (Hilden)的Quick PCR純化試劑盒由PCR積成物（PCR-Ansatz)進行純化。為連接 PCR產物與載體，借助多核苷酸激酶（New England Biolabs, Frankfurt)將5'-磷酸連接 至PCR產物。在這方面，遵循生產商的推薦。
[0063] 將載體用限制性內切核酸酶Λ?αΙΙΙΙ和消化，并由此除去包含的基因/式展芽 廣//磨W。在1%濃度的TAE瓊脂糖凝膠上拆分限制酶切消化的積成物?？勺R別具有5696 bp和1124 bp大小的2個帶。為了從瓊脂糖凝膠分離載體DNA，使用解剖刀從凝膠分離5696 bp的DNA帶，并根據(jù)生產商的信息使用得自Qiagen (Hilden)的Quick Gel Extraction Kit進行純化。為了制備平頭末端，使用DNA聚合酶I (New England