代、缺失或添加等）。
[0044] 在某些實施方案中，所述分離的核酸分子包含的核苷酸序列可與SEQIDNO:2或 SEQIDNO:3所示的核苷酸序列或者編碼SEQIDN0:9的核苷酸序列在嚴格條件下雜交。術(shù) 語"雜交"，如本文中所使用的，是指兩條單鏈核酸之間的結(jié)合、退火或堿基配對的過程。"雜 交的嚴格性"由溫度和離子強度的條件確定。核酸雜交體的穩(wěn)定性表示為解鏈溫度或Tm， 其是雜交體在確定的條件下發(fā)生50%變性時的溫度。已得到公式來估計給定的雜交體的 Tm;該公式考慮了核酸的G+C含量，雜交核酸的長度等（例如，Sambrook等，1989)。為了使 兩條核酸鏈之間的退火率達到最大，通常在比Tm低大約20-25°C的溫度下在高離子強度的 溶液（6xSSC或6xSSPE)中進行雜交。如果待雜交的序列不同一，則對于每1 %的錯配，雜 交溫度降低1-1. 5°C。通常，清洗條件應(yīng)當(dāng)盡可能嚴格（S卩，在比計算的Tm低大約12-20°C 的溫度下在低離子強度中）。例如，高嚴格條件通常包括在68°C下在6xSSC/5xDenhardt's 溶液/I. 0%SDS中進行雜交和在65°C下在0. 2xSSC/0. 1%SDS中進行清洗。在溶液中進 行的雜交與使用固定的核酸進行的雜交之間的最適雜交條件通常不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員將 了解操縱哪些參數(shù)以最優(yōu)化雜交。
[0045] 4、重組載體
[0046] 在又一個方面，本發(fā)明提供一種重組載體，其包含本發(fā)明的分離的核酸分子。
[0047] 可以將本發(fā)明的分離的核酸分子和調(diào)控序列連接在一起來制備重組表達載體，該 表達載體可以包括1或多個方便的限制位點，以便在這些位點插入或取代編碼多肽的核酸 序列。或者，可以通過將核酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入適當(dāng)?shù)谋磉_載體而表達 本發(fā)明所述核酸序列。制備表達載體時，可使編碼序列位于載體中以便與適當(dāng)?shù)谋磉_調(diào)控 序列可操作連接。所述調(diào)控序列可包括表達本發(fā)明的表位多肽或多肽偶聯(lián)物所必需或有利 的所有組分。每個調(diào)控序列對于編碼多肽（抗原表位）的核酸序列可以是天然含有的或外 來的。這些調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號 序列和轉(zhuǎn)錄終止子，以及其任何組合。最低限度，調(diào)控序列要包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的 終止信號。為了導(dǎo)入特定的限制位點以便將調(diào)控序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)進行 連接，可以提供帶接頭的調(diào)控序列。
[0048] 重組表達載體可以是任何便于進行重組DNA操作并表達核酸序列的載體（例如 質(zhì)?；虿《荆?。載體的選擇通常取決于載體與它將要導(dǎo)入的宿主細胞的相容性。載體可以 是線性或閉環(huán)質(zhì)粒。在某些實施方案中，所述重組載體為克隆載體或表達載體。
[0049] 5、宿主細胞
[0050] 另一方面，本發(fā)明提供一種重組宿主細胞，其含有本發(fā)明的重組載體。
[0051] 在某些實施方案中，可將包含本發(fā)明的核酸分子的重組載體導(dǎo)入宿主細胞，從而 使該載體以上述染色體整合體或自我復(fù)制的染色體外載體形式得以維持。在某些實施方案 中，宿主細胞可以是原核細胞或者真核細胞，例如細菌或酵母細胞。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知的技術(shù)將載體導(dǎo)入宿主細胞。
[0052] 6、類病毒顆粒
[0053] 本發(fā)明還涉及，能夠展示本發(fā)明的表位多肽或其變體的類病毒顆粒。在某些實施 方案中，所述表位多肽或其變體典型地通過與載體蛋白融合，經(jīng)過蛋白純化和組裝后可形 成類病毒顆粒，并將所述表位多肽或其變體展示在類病毒顆粒表面，使其仍保持誘導(dǎo)親和 抗體產(chǎn)生的能力。
[0054] 在某些實施方案中，所述類病毒顆粒包含融合蛋白或由融合蛋白構(gòu)成，所述融合 蛋白包含本發(fā)明所述的表位多肽或其變體，以及載體蛋白。在某些實施方案中，所述載體蛋 白優(yōu)選地為HBcAg蛋白或其片段。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述HBcAg蛋白的片段為 由HBcAg的aa1-149構(gòu)成的蛋白。在某些實施方案中，所述融合蛋白包含如SEQIDN0:9 所示的氨基酸序列、其變體或衍生物。
[0055] 7、雜交瘤
[0056] 在另一個方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，所述單克隆抗體特異性結(jié) 合本發(fā)明的分離的表位多肽和/或多肽偶聯(lián)物。
[0057] 在一個具體實施方案中，所述雜交瘤為雜交瘤細胞株L8F12,其保藏編號為 CCTCCN0:C2014101，保藏日期為2014年5月21日，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址為武漢市武昌珞珈山（郵編430072)。
[0058] 8、抗體及抗體偶聯(lián)物
[0059] 在又一個方面，本發(fā)明提供抗體或抗體片段，其能夠特異性地結(jié)合本發(fā)明的表位 多肽或其變體、本發(fā)明的多肽偶聯(lián)物和/或本發(fā)明的展示上述表位多肽的類病毒顆粒。
[0060] 在某些實施方案中，所述抗體具有：（a)如SEQIDNO: 16所示的重鏈CDRl;(b) 如SEQIDNO: 17 所示的重鏈CDR2 ; (c)如SEQIDNO: 18 所示的重鏈CDR3 ; (d)如SEQID NO: 19 所示的輕鏈CDRl; (e)如SEQIDNO:20 所示的輕鏈CDR2 ;和，（f)如SEQIDNO:21 所示的輕鏈⑶R3。
[0061]在某些實施方案中，所述抗體具有：(a)單克隆抗體L8F12的重鏈可變區(qū)，和，（b) 單克隆抗體L8F12的輕鏈可變區(qū)。
[0062] 在某些實施方案中，所述抗體選自單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗 體。在某些實施方案中，所述抗體片段選自多特異性抗體、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、抗獨特 型（抗-Id)抗體、雙抗體、微型抗體、納米抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、Fab片段、F(ab'）片段、二 硫化物連接的雙特異性Fv(sdFv)和胞內(nèi)抗體。
[0063] 在某些實施方案中，所述抗體或抗體片段選自單克隆抗體、多特異性抗體、人源化 抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、抗獨特型（抗-Id)抗體、 雙抗體、微型抗體、納米抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、Fab片段、F(ab'）片段、二硫化物連接的雙特 異性Fv(sdFv)和胞內(nèi)抗體。
[0064] 在某些實施方案中，所述抗體為單克隆抗體。在某些實施方案中，所述抗體為本發(fā) 明的雜交瘤細胞株產(chǎn)生的抗體L8F12。在某些實施方案中，所述抗體或抗體片段為與單克 隆抗體L8F12具有相同的結(jié)合特異性的抗體，例如與單克隆抗體L8F12具有相同的重鏈和 /或輕鏈可變區(qū)的抗體，或者與單克隆抗體L8F12具有相同的重鏈和/或輕鏈互補決定區(qū) (CDR)的抗體。
[0065] 在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體為鼠源或人源或羊源或其它動物來源，或為基 因工程抗體，例如人抗體、人源化抗體、嵌合抗體或單鏈抗體。
[0066] 本發(fā)明還提供抗體偶聯(lián)物，其包括本發(fā)明的抗體或抗體片段，以及偶聯(lián)部分。在某 些實施方案中，所述偶聯(lián)部分為選自放射性核素、藥物、毒素、細胞因子、酶、熒光素、載體蛋 白、脂類、和生物素中的一種或多種。
[0067] 本發(fā)明還提供一種試劑盒，其包含本發(fā)明的抗體或抗體片段、或者本發(fā)明的抗體 偶聯(lián)物。
[0068] 在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體片段、或者抗體偶聯(lián)物特異性識別病毒 EV71、CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和/或CB2中的一種或多種。在某些實施方案 中，病毒EV71的代表性毒株為JS06-52-3 (其GenBank登錄號為FJ600325)。在某些實施方 案中，病毒CA16的代表性毒株為TW07-00190(其GenBank登錄號為JF420566)。在某些實 施方案中，病毒CB3的代表性毒株為XM08-2035 (其GenBank登錄號為JQ042700)。在某些 實施方案中，病毒CA6的代表性毒株為141 (其GenBank登錄號為JF420565)。在某些實施 方案中，病毒CB5的代表性毒株為09-5428 (其GenBank登錄號為JQ042699)。在某些實施 方案中，病毒CA2的代表性毒株為3352 (其GenBank登錄號為JF420570)。在某些實施方案 中，病毒CA9的代表性毒株為4629 (其GenBank登錄號為JQ042702)。在某些實施方案中， 病毒CB2的代表性毒株為09-3985(其GenBank登錄號為JQ042701)。在某些實施方案中， 病毒PVl的代表性毒株具有GenBank登錄號VOl149. 1。
[0069] 在某些具體實施方案中，所述抗體為單克隆抗體L8F12(IgG3)，其由雜交瘤細胞株 L8F12產(chǎn)生（保藏編號為CCTCCN0:C2014101，保藏日期為2014年5月21日，保藏單位為 中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏地址為武漢市武昌珞珈山（郵編430072))。
[0070] 在其它的實施方案中，所述抗體為與單克隆抗體L8F12(IgG3)具有相同的結(jié)合特 異性的抗體，例如與單克隆抗體L8F12具有相同的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的抗體，或者與單 克隆抗體L8F12具有相同的重鏈和/或輕鏈互補決定區(qū)（CDR)的抗體。
[0071]在某些具體實施方案中，所述抗體的6個互補決定區(qū)（CDR)分別為單克隆抗體L8F12(IgG3)所包含的6個⑶R。在某些具體實施方案中，所述抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)分 別為單克隆抗體L8F12(IgG3)所包含的重鏈和輕鏈可變區(qū)。
[0072]在另一個方面，本發(fā)明還提供一種分離的核酸分子，其包含編碼本發(fā)明所述的抗 體或抗體片段的核酸序列。此類核酸分子可以從雜交瘤細胞中分離得到，也可以利用基因 工程重組技術(shù)或化學(xué)合成方法獲得。
[0073]在某些實施方案中，所述抗體具有：（a)如SEQ ID NO: 16所示的重鏈CDRl;(b) 如SEQ ID NO: 17所示的重鏈CDR2 ; (c)如SEQ ID NO: 18所示的重鏈CDR3 ; (d)如SEQ ID NO: 19所示的輕鏈CDRl ; (e)如SEQ ID NO:20所示的輕鏈CDR2 ;和，（f)如SEQ ID NO:21 所示的輕鏈⑶R3。
[0074]在某些實施方案中，所述抗體具有：(a)單克隆抗體L8F12的重鏈可變區(qū)，和，（b)單克隆抗體L8F12的輕鏈可變區(qū)。
[0075]在另一個方面，本發(fā)明還提供一種載體，其包含如上所述的分離的核酸分子。本發(fā) 明的載體可以是克隆載體，也可以是表達載體。在某些實施方案中，本發(fā)明的載體是例如質(zhì) 粒，粘粒，噬菌體，柯斯質(zhì)粒等等。
[0076]在另一個方面，還提供了包含如上所述的分離的核酸分子或載體的宿主細胞。此 類宿主細胞包括但不限于，原核細胞例如大腸桿菌細胞，以及真核細胞例如酵母細胞，昆蟲 細胞，植物細胞和動物細胞（如哺乳動物細胞，例如小鼠細胞、人細胞等）。本發(fā)明的細胞還 可以是細胞系，例如293T細胞。
[0077]在另一個方面，還提供了制備本發(fā)明的抗體或抗體片段的方法，其包括，在合適的 條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞，和從細胞培養(yǎng)物中回收本發(fā)明的抗體或抗體片段。
[0078] 9、組合物
[0079]在另一個方面，本發(fā)明還提供組合物。
[0080]在某些實施方案中，所述組合物包含本發(fā)明的分離的表位多肽或其變體、多肽偶 聯(lián)物、分離的核酸分子、載體、宿主細胞和/或類病毒顆粒。在某些實施方案中，所述組合物 還包含藥學(xué)上可接受的載體或輔料。
[0081]在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含本發(fā)明的抗體或其片段或者本發(fā)明的抗 體偶聯(lián)物。在某些實施方案中，所述組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體或輔料。
[0082]在某些實施方案中，所述組合物為藥物組合物或診斷組合物。例如，所述組合物 可用于疾病的診斷或治療。所述疾病可以為，病毒感染（例如腸病毒感染），或與病毒感染 (例如腸病毒感染）相關(guān)的疾病，例如手足口病。所述病毒可以為例如，病毒EV71、CVA16、 CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和/或CB2。
[0083]術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"意指經(jīng)有關(guān)管理機構(gòu)批準(zhǔn)或公認藥典中所列用于動物，更 特別地用于人的。術(shù)語"載體"是指與試劑一起施用的稀釋劑、佐劑（例如，弗氏完全和不完 全佐劑）、賦形劑或媒介物。這樣的載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油、動物、植物 或合成來源的那些，包括例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)靜脈內(nèi)施用藥物和/或 診斷組合物時，水是常用載體。鹽水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可被用作液體載體，特 別是用于可注射溶液。適當(dāng)?shù)乃幬镔x形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、 面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、無水脫脂乳、甘油、丙烯、乙二 醇、水、乙醇等。藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑和穩(wěn)定劑的另外實例包括但不限于緩沖劑例 如磷酸鹽、檸檬酸鹽以及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量多肽；蛋白質(zhì)，例 如血清白蛋白和明膠；親水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸，谷氨酰胺， 天冬酰胺，精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖以及其它糖類包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑 例如EDTA;糖醇例如甘露醇或山梨醇；形成鹽的抗衡離子例如鈉；和/或非離子型表面活 性劑例如TWEEN?、聚乙二醇（PEG)和PLURONICS?，如本領(lǐng)域中已知的。除了上述成分外，本 發(fā)明的藥物和/或診斷組合物還可包括潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、調(diào)味劑、乳化劑、懸浮劑和 防腐劑。這些組合物可采取溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、持續(xù)釋放制劑等 形式。
[0084] 10、方法
[0085]在另一個方面，本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防和/或診斷人腸道病毒所致疾病 和/或檢測腸道病毒滴度和/或檢測腸道病毒中和抗體效價的方法，包括使用有效量的本 發(fā)明的表位多肽或其變體、多肽偶聯(lián)物、抗體或其片段、抗體偶聯(lián)物和/或組合物的步驟。 [0086] 在又一個方面，本發(fā)明涉及一種免疫組織化學(xué)檢測方法，其包括使用本發(fā)明的抗 體或抗體片段、或者本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物。
[0087]本發(fā)明的方法可以用于體內(nèi)或體外應(yīng)用。本發(fā)明的方法可以用于治療目的，診斷 目的，或者非治療非診斷目的。例如，本發(fā)明方法可應(yīng)用于受試者，以診斷，預(yù)防或治療受試 者中人腸道病毒所致的疾病。此外，本發(fā)明方法可應(yīng)用于體外樣品（例如細胞培養(yǎng)物，病毒 培養(yǎng)物等等），以確定腸道病毒在樣品中的存在或其水平，或者腸道病毒中和抗體的存在或 其效價。
[0088]在具體的實施方案中，所述疾病可以是手足口病。
[0089]在具體的實施方案中，所述腸道病毒可以為病毒EV71、CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和/或CB2中的一種或多種。
[0090] 11、用途
[0091]在另一個方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的分離的表位多肽或其變體、多肽偶聯(lián)物、展示 所述表位多肽的類病毒顆?；蛘弑景l(fā)明的組合物在制備用于治療和/或預(yù)防和/或診斷腸 道病毒所致疾病和/或檢測腸道病毒滴度和/或檢測腸道病毒中和抗體效價的試劑（例如 藥物）中的用途。
[0092]在又一個方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的抗體或抗體片段、本發(fā)明的抗體偶聯(lián)物、本發(fā) 明的組合物在制備用于治療和/或預(yù)防和/或診斷腸道病毒所致疾?。ㄌ貏e是手足口?。?和/或檢測腸道病毒滴度的試劑（例如藥物）中的用途。
[0093]在具體的實施方案中，所述疾病為手足口病。
[0094]在具體的實施方案中，所述腸道病毒可以為病毒EV71、CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和/或CB2中的一種或多種。
[0095]本發(fā)明的表位多肽具有良好的親和活性和抗原性。在某些實施方案中，本發(fā)明的 表位多肽、抗體、組合物等能夠被用于治療和/或預(yù)防和/或診斷人腸道病毒所致疾病和/ 或檢測人腸道病毒滴度和/或檢測人腸道病毒中和抗體效價。
[0096]定義
[0097] 如本文中所使用的，當(dāng)提及腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C的氨基酸序列時，其使用EV71 病毒株（JS06-52-3)的非結(jié)構(gòu)蛋白2C的氨基酸序列（SEQIDNO:10所示的序列）來進行 描述。例如，表述"腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C的第155-170位氨基酸殘基（aa155-170) "是 指，SEQIDNO:10所示的多肽的第155-170位氨基酸殘基。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在 腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C的氨基酸序列中，可天然產(chǎn)生或人工引入突變或變異（包括但不限 于，置換，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亞型的HBcAg)，而不影響其生物學(xué)功能。 例如，在腸道病毒的不同病毒株（例如，CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和CB2)中，非 結(jié)構(gòu)蛋白2C的氨基酸序列可天然存在差異（突變或變異），而不影響其生物學(xué)功能。因此， 在本發(fā)明中，術(shù)語"腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C"應(yīng)包括所有此類序列，包括例如SEQIDNO:10 所示的序列以及其天然或人工的變體。并且，當(dāng)描述腸道病毒非結(jié)構(gòu)