具體方法描述參考實施例5。
[0263] 本實施例隨機選取了 5份江蘇⑶C的手足口病病人血清分別進行EV71、CVA16、 CVB3的中和檢測。采用融合蛋白抗血清檢測HFMD病人的血清樣品中和抗體結(jié)果顯示（表 10)，病人血清能夠中和EV71、CVA16及CVB3中的一種或幾種。
[0264] 表10.臨床血清背景資料及中和抗體滴度檢測結(jié)果
[0265]
[0266] 該5份樣品性別及年齡采集時未記錄
[0267]實施例14:人腸道病毒廣譜親和表位多肽的單克降抗體用于檢測腸道病毒感染 的動物組織
[0268] 將實施例10獲得親和單抗L8F12用于腸道病毒感染的小鼠的免疫組織化學(xué)檢測， 本實施例選擇腸道病毒EV71進行檢測，方法步驟如下：
[0269] 1日齡新生BALB/c小鼠通過腹腔方式攻毒EV71-B3亞型（GenebankNo.AB469182) 的鼠適應(yīng)株P(guān)SVA-MP4,攻毒劑量為IO7TCID5。，對照組攻毒等體積的PBS緩沖液。每組均含8 只小鼠。在攻毒后第6天，將小鼠處死，將臟器充分暴露后浸泡于福爾馬林溶液中室溫靜置 72小時。將固定后的組織進行脫水，包埋于蠟塊后進行切片（4ym厚）。檢測用免疫組織 化學(xué)超敏試劑盒及生物素-鏈霉素DAB染色試劑均購自福州邁新生物科技有限公司，免疫 組織化學(xué)檢測步驟按照試劑盒說明書進行。檢測用一抗為針對2C的廣譜親和單抗L8F12， 檢測用濃度為lmg/mL，稀釋度為1 :1，1000。
[0270] 結(jié)果如圖10所示，在感染EV71的小鼠的大腦、脊髓和肌肉中發(fā)現(xiàn)了陽性染色信 號，而未感染EV71的小鼠的大腦、脊髓和肌肉檢測結(jié)果為陰性。說明針對2C的廣譜親和單 抗能特異性得檢測出被腸道病毒感染的小鼠組織，能夠應(yīng)用于腸道病毒感染的免疫組織化 學(xué)檢測。
[0271]實施例15:抗人腸道病毒廣譜親和表位多肽的單克降抗體的輕鏈及重鏈可奪岡 的序歹!1側(cè)丨定
[0272] 半貼壁培養(yǎng)IO7個L8F12鼠源雜交瘤細胞，吹管吹起貼壁細胞使之懸浮，將其 轉(zhuǎn)移到新的4ml離心管中，并1500rpm離心3min。收集沉淀的細胞，重懸于100y1無菌 PBS(pH7. 45)中，并轉(zhuǎn)移到一新的I. 5ml離心管中，加入 800yITrizol(Roche，Germany)， 輕輕顛倒混勾，靜置lOmin。加入200y1氯仿，劇烈振蕩15s，靜置10min，4°C12000rpm離 心15min，轉(zhuǎn)移上層液體至一新的I. 5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，混勾，靜置lOmin。 4°C12000rpm離心5min，棄上清，沉淀于60°C真空抽干5min。透明的沉淀溶于70yl DEPCH2O中，加入Iy1 反轉(zhuǎn)錄引物Oligo(dT) (12 1S) (Promega)，IyIdNTP(上海生工），置 于72°C水浴10min，立即放到冰浴中置5min，加入20yI5X反轉(zhuǎn)錄緩沖液，2yIAMV(K)U/ U1，Promega)，IyIRnasin(40U/y1，Promega)，混勾后于 42°C將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0273] 輕鏈基因的分離使用上述cDNA為模板，以MVkF_F4為上游引物，以MVkR_M13為下 游引物，進行PCR擴增，獲得一條大小約500bp的DNA片段，PCR條件為：95°C 3min，23個循 環(huán)的（95°C 15s，56°C 30s，72°C 30s)，72°C 5min。回收后進行測序。序列經(jīng)blast比對后確 定為L8F12的輕鏈序列。
[0274] 重鏈基因的分離使用上述cDNA為模板，以MVhF_E3為上游引物，以MVhR_M13為下 游引物，進行PCR擴增，獲得一條大小約為500bp的DNA片段，PCR條件為：95°C3min，23個 循環(huán)的（95°C15s，56°C30s，72°C30s)，72°C5min?；厥蘸筮M行測序。序列經(jīng)blast比對后 確定為L8F12的重鏈序列。
[0275] 表11.測序使用的引物
[0276]
[0277]進一步，使用Kabat編號系統(tǒng)，在測序獲得的L8F12的重鏈序列和輕鏈序列中，確定 了單抗L8F12的輕鏈及重鏈的⑶R序列，示于表12中。
[0278] 表12.單抗L8F12的輕鏈/重鏈的⑶R序列
[0279]
[0280] 盡管上文中詳細描述了本發(fā)明的某些具體實施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解， 根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對其中的細節(jié)進行各種修改和替換而不偏離本發(fā)明的精神 和主旨，這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的范圍僅由所附的權(quán)利要求及其任 何等同方案限定。
【主權(quán)項】
1. 一種分離的表位多肽或其變體，其中，所述表位多肽由腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C的連 續(xù)氨基酸片段組成，并且包含腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C的aa 155-170,并且，所述連續(xù)氨基 酸片段的長度為16-30個氨基酸，例如16-25個、16-20個氨基酸；所述變體與所述表位多 肽的區(qū)別在于個或幾個（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個）氨基酸取代、缺失或添 加，并且保留所述表位多肽的活性（例如，誘導(dǎo)廣譜親和抗體產(chǎn)生的能力）； 優(yōu)選地，所述腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C的aa 155-170如SEQ ID NO :1和22-85任一項 所示； 優(yōu)選地，所述表位多肽或其變體包含選自下列的氨基酸序列，或由選自下列的氨基酸 序列組成： a) 如SEQ ID NO :1和22-85任一項所示的氨基酸序列； b) 與SEQ ID NO :1和22-85任一項所示的氨基酸序列具有至少45%的序列同一性，例 如至少50 %，至少55 %，至少60 %，至少65 %，至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %， 至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95 %序列同一性的氨基酸序 列；和 c) 相對于SEQ ID NO :1和22-85任一項所示的氨基酸序列包含一個或幾個（例如1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個）氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列； 優(yōu)選地，所述氨基酸取代或缺失發(fā)生在一個或多個選自下列的位置處：相應(yīng)于SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的第2、3、5、6、8、9和/或12位氨基酸殘基的位置處（即，相應(yīng)于腸道 病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C的第156、157、159、160、162、163和/或166位氨基酸殘基的位置處）； 優(yōu)選地，所述表位多肽選自： (a) 表位多肽，它為腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C的片段（其長度為16-30個氨基酸，例如 16-25個或16-20個氨基酸），并且含有腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C的aa 155-170 (例如，SEQ ID NO :1和22-85任一項所示的氨基酸序列）； (b) 表位多肽，它是在腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C的aa 155-170(例如，SEQ ID NO :1和 22-85任一項所示的氨基酸序列）的基礎(chǔ)上經(jīng)一個或者幾個（例如1-5個、1-10個或1-15 個）氨基酸的延伸和/或替換而得到的；和 (c) 表位多肽，它的氨基酸序列與腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C的aal55-170(例如，SEQ ID NO :1和22-85任一項所不的氨基酸序列）相異在于一個或者幾個（例如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10個）氨基酸的延伸和/或替換； 優(yōu)選地，所述表位多肽或其變體具有誘導(dǎo)廣譜親和抗體產(chǎn)生的能力； 優(yōu)選地，所述表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :1和22-85任一項所示； 優(yōu)選地，所述變體與所述表位多肽的區(qū)別在于選自下列的位置處的一個保守性置換： 相應(yīng)于SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的第2、3、5、6、8、9和/或12位氨基酸殘基的位置處 (即，相應(yīng)于腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C的第156、157、159、160、162、163和/或166位氨基酸 殘基的位置處）。2. 多肽偶聯(lián)物，其包含權(quán)利要求1的表位多肽或其變體，和偶聯(lián)部分； 優(yōu)選地，所述偶聯(lián)部分選自放射性核素、藥物、毒素、細胞因子、酶、熒光素、載體蛋白、 脂類、和生物素中的一種或多種； 優(yōu)選地，所述多肽偶聯(lián)物為融合蛋白或類病毒顆粒； 優(yōu)選地，所述偶聯(lián)部分為HBcAg蛋白或其片段（例如，HBcAg蛋白的aa 1-149); 優(yōu)選地，所述分離的表位多肽或其變體與所述偶聯(lián)部分通過連接子相連；優(yōu)選地，所述 連接子為肽或多肽，例如氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示的肽或多肽； 優(yōu)選地，所述多肽偶聯(lián)物包含如SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列、其變體或衍生物。3. 分離的核酸分子，其編碼權(quán)利要求1所述的表位多肽或其變體，或者權(quán)利要求2所述 的多肽偶聯(lián)物； 優(yōu)選地，所述分離的核酸分子包含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO: 3中所示的核苷酸序列， 其衍生物或變體，或由它們組成； 優(yōu)選地，所述分離的核酸分子包含的核苷酸序列編碼包含如SEQ ID N0:9所示的氨基 酸序列的融合蛋白，其衍生物或變體，或由它們組成； 優(yōu)選地，所述分離的核酸分子包含的核苷酸序列與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所示 的核苷酸序列或者編碼SEQ ID N0:9的核苷酸序列具有至少45%的序列同一性，例如至少 50 %，至少55 %，至少60 %，至少65 %，至少70 %，至少75 %，至少80 %，至少85 %，至少 90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%的序列同一性； 優(yōu)選地，所述分離的核酸分子包含的核苷酸序列為在如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3 所示的核苷酸序列或者編碼SEQ ID N0:9的核苷酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾 個（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個）核苷酸而衍生的核苷酸序列； 優(yōu)選地，所述分離的核酸分子包含的核苷酸序列可與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3所 示的核苷酸序列或者編碼SEQ ID N0:9的核苷酸序列在嚴格條件下雜交。4. 重組載體，其包含權(quán)利要求3所述的分離的核酸分子，以及任選的調(diào)控序列； 優(yōu)選地，所述調(diào)控序列選自前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號序 列、轉(zhuǎn)錄終止子，或其任何組合； 優(yōu)選地，所述重組載體為克隆載體或表達載體。5. 宿主細胞，其包含權(quán)利要求4所述的重組載體； 優(yōu)選地，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞。6. 類病毒顆粒，其能夠展示權(quán)利要求1所述的表位多肽或其變體； 優(yōu)選地，所述類病毒顆粒包含融合蛋白或由融合蛋白構(gòu)成，所述融合蛋白包含權(quán)利要 求1所述的表位多肽或其變體，以及載體蛋白； 優(yōu)選地，所述載體蛋白為HBcAg蛋白或其片段（例如，HBcAg的aal-149); 優(yōu)選地，所述融合蛋白包含如SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列、其變體或衍生物。7. 組合物，其包含權(quán)利要求1的表位多肽或其變體、權(quán)利要求2的多肽偶聯(lián)物、權(quán)利要 求3的分離的核酸分子、權(quán)利要求4的重組載體、權(quán)利要求5的宿主細胞和/或權(quán)利要求6 的類病毒顆粒， 優(yōu)選地，所述組合物還包含藥學(xué)上可接受的載體或輔料； 優(yōu)選地，所述組合物為藥物組合物或診斷組合物。8. 雜交瘤，其為雜交瘤細胞株L8F12,其保藏編號為CCTCC N0:C2014101，保藏日期為 2014年5月21日，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)。9. 抗體或其抗體片段，其能夠特異性地結(jié)合權(quán)利要求1的表位多肽或其變體、權(quán)利要 求2的多肽偶聯(lián)物和/或權(quán)利要求6的類病毒顆粒； 優(yōu)選地，所述抗體具有：（a)如SEQ ID NO: 16所示的重鏈CDRl ;(b)如SEQ ID NO: 17 所示的重鏈CDR2 ; (c)如SEQ ID NO :18所示的重鏈CDR3 ;(d)如SEQ ID NO :19所示的輕鏈 CDRl ; (e)如 SEQ ID N0:20 所示的輕鏈 CDR2 ;和，（f)如 SEQ ID N0:21 所示的輕鏈 CDR3 ; 優(yōu)選地，所述抗體具有：(a)單克隆抗體L8F12的重鏈可變區(qū)，和，（b)單克隆抗體 L8F12的輕鏈可變區(qū)，所述單克隆抗體L8F12由權(quán)利要求8所述的雜交瘤產(chǎn)生； 優(yōu)選地，所述抗體選自單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體； 優(yōu)選地，所述抗體片段選自多特異性抗體、單鏈Fv(ScFv)、單鏈抗體、抗獨特型 (抗-Id)抗體、雙抗體、微型抗體、納米抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、Fab片段、F(ab'）片段、二硫化 物連接的雙特異性Fv (sdFv)和胞內(nèi)抗體； 優(yōu)選地，所述抗體或抗體片段為鼠源或人源或羊源或其它動物來源的； 優(yōu)選地，所述抗體為單克隆抗體L8F12,其由權(quán)利要求8所述的雜交瘤產(chǎn)生； 優(yōu)選地，所述抗體或抗體片段特異性識別病毒EV71、CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、 CA9和/或CB2中的一種或多種； 優(yōu)選地，所述抗體或抗體片段為與單克隆抗體L8F12具有相同的結(jié)合特異性的抗體， 例如與單克隆抗體L8F12具有相同的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的抗體，或者與單克隆抗體 L8F12具有相同的重鏈和/或輕鏈互補決定區(qū)（CDR)的抗體。10. 抗體偶聯(lián)物，其包括權(quán)利要求9所述的抗體或抗體片段以及偶聯(lián)部分； 優(yōu)選地，所述偶聯(lián)部分為選自放射性核素、藥物、毒素、細胞因子、酶、熒光素、載體蛋 白、脂類、和生物素中的一種或多種； 優(yōu)選地，所述抗體偶聯(lián)物特異性識別病毒EV71、CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和 /或CB2中的一種或多種。11. 試劑盒，其包含權(quán)利要求9所述的抗體或抗體片段，或者權(quán)利要求10所述的抗體偶 聯(lián)物。12. 組合物，所述組合物包含權(quán)利要求9的抗體或其片段或者權(quán)利要求10的抗體偶聯(lián) 物， 優(yōu)選地，所述組合物包含藥學(xué)上可接受的載體或輔料； 優(yōu)選地，所述組合物為藥物組合物或診斷組合物。13. 權(quán)利要求1的表位多肽或其變體、權(quán)利要求2的多肽偶聯(lián)物、權(quán)利要求7的類病毒 顆粒、或權(quán)利要求8的組合物在制備用于治療和/或預(yù)防和/或診斷腸道病毒所致疾病和 /或檢測腸道病毒滴度和/或檢測腸道病毒中和抗體效價的試劑（例如藥物）中的用途； 優(yōu)選地，所述腸道病毒為病毒EV71、CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和/或CB2中 的一種或多種； 優(yōu)選地，所述疾病為手足口病。14. 權(quán)利要求9的抗體或抗體片段、權(quán)利要求10的抗體偶聯(lián)物或者權(quán)利要求12的組合 物在制備用于治療和/或預(yù)防和/或診斷腸道病毒所致疾病和/或檢測腸道病毒滴度的試 劑（例如藥物）中的用途； 優(yōu)選地，所述腸道病毒為病毒EV71、CVA16、CB3、CA6、CB5、PV1、CA2、CA9和/或CB2中 的一種或多種； 優(yōu)選地，所述疾病為手足口病。15. 分離的核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求9所述的抗體或抗體片段的核酸序列； 優(yōu)選地，所述抗體具有：（a)如SEQ ID NO: 16所示的重鏈CDRl; (b)如SEQ ID NO: 17 所示的重鏈CDR2 ; (c)如SEQ ID NO: 18所示的重鏈CDR3 ;(d)如SEQ ID NO: 19所示的輕鏈 CDRl ; (e)如 SEQ ID N0:20 所示的輕鏈 CDR2 ;和，（f)如 SEQ ID N0:21 所示的輕鏈 CDR3 ; 優(yōu)選地，所述抗體具有：(a)單克隆抗體L8F12的重鏈可變區(qū)，和，（b)單克隆抗體 L8F12的輕鏈可變區(qū)，所述單克隆抗體L8F12由權(quán)利要求8所述的雜交瘤產(chǎn)生。16. -種載體，其包含權(quán)利要求15的分離的核酸分子。17. -種宿主細胞，其包含權(quán)利要求15的分離的核酸分子，或權(quán)利要求16的載體。18. 制備權(quán)利要求9所述的抗體或抗體片段的方法，其包括，在合適的條件下培養(yǎng)權(quán)利 要求17的宿主細胞，和從細胞培養(yǎng)物中回收所述抗體或抗體片段。
【專利摘要】本發(fā)明屬于免疫生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種表位多肽、如人腸道病毒的廣譜親和表位多肽及其用途，還涉及一種可與上述表位多肽結(jié)合的抗體及其用途。本發(fā)明還涉及所述親和表位多肽或所述抗體在制備治療和/或預(yù)防和/或診斷人腸道病毒和/或鑒定人腸道病毒滴度和/或鑒定人腸道病毒中和抗體效價的藥物或方法中的用途。本發(fā)明的親和表位多肽和抗體可用于治療和/或預(yù)防和/或診斷人腸道病毒和/或鑒定人腸道病毒滴度和/或鑒定人腸道病毒中和抗體效價的藥物或方法中。CCTCC NO: C201410120140521
【IPC分類】C07K16/10, C12Q1/70, A61K38/08, A61K38/10, C12N5/20, G01N33/569, C12N7/01, C12N15/41, C12N15/13, C07K7/06, C07K7/08, A61P31/14
【公開號】CN105085626
【申請?zhí)枴緾N201510262810
【發(fā)明人】程通, 徐龍發(fā), 李志群, 鄭郡, 楊立生, 何德磊, 葉祥忠, 夏寧邵
【申請人】廈門大學(xué), 北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年5月22日