70)區(qū)段的上下游引物通過互搭，獲得具有BamHI和EcoRI 粘性末端的片段（克隆構(gòu)建的具體方法步驟參照參考文獻(xiàn)，XuL，etal. 2014.Protection againstLethalEnterovirus7IChallengeinMicebyaRecombinantVaccine CandidateContainingaBroadlyCross-NeutralizingEpitopewithintheVP2EF Loop.Theranostics4:498-513.)。各取IyL的上下游引物，同時加入48yL的結(jié)合緩沖 液（IOOmMNaCland50mMHEPESpH7. 4)，混合后于 90°C中反應(yīng) 4min,然后置于 70°C反 應(yīng)lOmin，緩慢地降到室溫。同時以BamHI和EcoRI雙酶切載體pT0-T7-C149,回收載 體后與互搭好的片段連接。連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566,進(jìn)行表達(dá)鑒定及質(zhì)粒酶切鑒定 (同時以PT0-T7-C149為空白對照），鑒定正確的質(zhì)粒即插入所需的目的片段，分別命名為 C149-2C(aal55-170)，構(gòu)建流程如圖 3。
[0212] C149-2C(aal55_170)融合蛋白的氨基酸序列為：
[0213]HMDIDPYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNL ATWVGSNLEDGGGGSGGGGTGSYSLPPDPDHFDGYKQQEFGGGGSGGGGSRELVVSYVNVNMGLKIRQLLWFHISCL TLGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPQNAPILSTLPETTVV(SEQIDN0:9)(其中斜體為插入的片段）。 將上述表達(dá)質(zhì)粒的ER2566菌以及含pT0-T7-C149空質(zhì)粒的ER2566菌，37°C震蕩培養(yǎng)至 0D600約0. 5,然后按1:1000的比例轉(zhuǎn)接擴大培養(yǎng)至500mLLB(含有硫酸卡那霉素）中，培 養(yǎng)至0D600約0? 8時，加入IPTG500yL，25°C誘導(dǎo)611。4°(：下收集菌體，8000rpm離心lOmin。 棄上清，菌體沉淀用IOmL/瓶的裂解液重懸。冰水浴，采用超聲破碎儀處理破碎細(xì)胞。超聲 條件：工作時間：3min/瓶；脈沖：打2sec，停5sec;輸出功率：60%。12000rpm離心10min， 保留上清。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，所有融合蛋白均為上清表達(dá)（圖4)。
[0214] 由于表達(dá)上清中含有很多雜蛋白，本發(fā)明人采用以下方式進(jìn)行純化并促進(jìn)蛋白自 發(fā)組裝形成顆粒：將超聲離心后得到上清至于65°C水浴中熱變性30min，12000rpm離心 10min。然后將純化后的蛋白在20mMPB6. 0含0. 3MNaCl的條件下促進(jìn)蛋白自發(fā)組裝形成 顆粒，再進(jìn)行電鏡觀察，組裝成功的顆粒呈均勻的空心球體，見圖5。
[0215] 將經(jīng)過純化并組裝的融合蛋白對6周齡BALB/c雌鼠進(jìn)行免疫，每種展示肽平行免 疫5只小鼠（編號為：鼠1到鼠5)，免疫劑量為100 y g/只，初免混合弗氏完全佐劑（購自 Sigma)，以后每隔兩周加強一次，加強時混合弗氏不完全佐劑（購自Sigma)，共加強三針， 在第三針加強后的第11天采血。
[0216]實施例7:人腸道病毒廣譜親和表位多肽與HBVcAg蛋白的融合表汰蛋白的免痔 血清與人腸道病毒的結(jié)合活件
[0217] 將實施例6中的C149-2C(aal55_170)融合蛋白抗血清對不同代表性的腸道病毒 采用免疫熒光進(jìn)行檢測。免疫熒光方法步驟參照實施例3。結(jié)果證明多肽抗血清能夠交叉 結(jié)合JS06-52-3、TW07-00190、XM08-2035、141 (CA6)、09-5428 (CB5)和PVl六種代表性腸道 病毒，感染的RD細(xì)胞顯示出綠色熒光，而未感染腸道病毒的RD細(xì)胞對照則沒有任何反應(yīng)， 說明C149-2C(aal55-170)融合蛋白的免疫血清能夠特異性交叉結(jié)合不同亞型的腸道病毒 (圖6)。這一結(jié)果表明，載體蛋白能夠以類病毒顆粒的形式來呈遞本發(fā)明的表位多肽。
[0218]實施例8:人腸道病毒廣譜親和表位多肽與HBVcAg蛋白的融合表汰蛋白的免痔 血清用于檢測人腸道病毒的感染和滴度
[0219] 將實施例6中的C149-2C(aal55_170)融合蛋白抗血清以梯度稀釋斑點計數(shù)方法 檢測腸道病毒的滴度。本實施例中我們選擇了實施例3中的六種腸道病毒，進(jìn)行感染滴度 的測定。具體步驟見實施例4。實驗結(jié)果示于下面的表7中。
[0220] 表7.腸道病毒的感染用量與對應(yīng)孔被感染細(xì)胞數(shù)的關(guān)系
[0221]
[0223]根據(jù)上述實驗結(jié)果可知，JS06-52-3、TW07-00190、XM08-2035、141(CA6)、 09-5428 (CB5)和PVl六種代表性腸道病毒的病毒效價分別為4. 06XIO5 (IU/mL)、 4. 52XIO5(IlVmL)、6. 3XIO5(IlVmL)、4. 44XIO5(IlVmL)、4. 74XIO5(IlVmL)和 4. 36XIO5(IUAiL)。本實施例的結(jié)果表明，針對融合蛋白C149-2C(aal55-170)的抗血清能 夠測定出不同代表性腸道病毒的感染滴度。
[0224]實施例9:人腸道病毒廣譜親和表位多肽與HBVcAg蛋白的融合表汰蛋白的免痔 血清用于檢測人腸道病毒中和抗體效價
[0225] 利用酶聯(lián)免疫斑點法，本實施例中我們將C149-2C(aal55_170)融合蛋白抗血清 用于檢測人腸道病毒中和抗體效價。具體方法描述參考實施例5。
[0226] 本實施例隨機選取了5份江蘇⑶C的手足口病病人血清分別進(jìn)行EV71、CVA16、 CVB3的中和檢測。采用融合蛋白抗血清檢測HFMD病人的血清樣品中和抗體結(jié)果顯示（表 8)，病人血清能夠中和EV71、CVA16及CVB3中的一種或幾種。
[0227] 表8.臨床血清背景資料及中和抗體滴度檢測結(jié)果
[0228]
[0229] 實施例10:抗人腸道病毒廣譜親和表位多肽的單克降抗體的制備
[0230] ⑴小鼠免疫
[0231] 1、免疫原的準(zhǔn)備：參照實施例6的融合蛋白的制備和免疫方法，初次免疫時使用 福氏完全佐劑，后續(xù)加強免疫使用福氏不完全佐劑，融合前72h的最后一次免疫加強時不 加佐劑。
[0232] 2、小鼠的基礎(chǔ)免疫：對6-8周齡BALB/c雌鼠使用上述病毒免疫原進(jìn)行多點注射， 包括背部皮下注射、腹股溝皮下注射、足墊注射、四肢肌肉注射等，注射劑量為500yL/只/ 次。每隔2周加強免疫一次，每次免疫前采集200yL眼框靜脈血或20yL尾靜脈血以備滴 度測定。當(dāng)小鼠血清滴度達(dá)到平臺期后，停止免疫，休息兩個月后進(jìn)行融合。
[0233] 3、單抗融合前72h的加強對激發(fā)抗體應(yīng)答十分重要，需在融合前72h對小鼠免疫 加強。直接用IOOyL0.5mg/mL的重組蛋白對小鼠進(jìn)行尾靜脈注射或脾臟免疫。脾臟免疫 前，需先用乙醚麻醉小鼠，剖開腹腔外皮取出脾臟，沿脾臟縱向注射100yL抗原，迅速手術(shù) 縫合腹皮切口
[0234] (2)融合雜交瘤的制備和篩選
[0235] 1、小鼠巨噬細(xì)胞的制備：（i)將一只6周齡左右的BALB/c小鼠處死，自來水沖 洗后，浸泡于75%乙醇溶液中5min。將小鼠放入超凈工作臺，腹部朝上。用鑷子提起小鼠 腹部皮膚，剪一小口，并用大鑷子向上下方向撕拉開皮膚，充分暴露腹部。（ii)用無菌鑷子 提起腹膜，換一把剪刀將腹膜中央處剪一小口，用ImL吸管通過小口向腹腔內(nèi)注入適量培 養(yǎng)液，用吸管小心在腹腔內(nèi)攪動，最后吸出培養(yǎng)液于離心管中。（iii)將腹腔細(xì)胞液溶解于 HAT培養(yǎng)液或HT培養(yǎng)液中，使終濃度為2X105/mL。（iv)將細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，也可直接與融合細(xì)胞混合后添加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。
[0236] 2、小鼠胸腺細(xì)胞的制備：（i)將一只13天齡左右的BALB/c小鼠引頸處死，自來 水沖洗，浸泡于75%乙醇溶液中5min。將小鼠放入超凈工作臺，腹部朝上。（ii)用鑷子提 起小鼠腹部皮膚，將腹部和胸部的外皮剪開。（iii)用另一把干凈的剪刀剪開胸腔，用鑷子 取出乳白色的胸腺。將胸腺研磨后通過200目細(xì)胞篩，得到胸腺飼養(yǎng)細(xì)胞液。
[0237] 3、小鼠骨髓瘤細(xì)胞的制備：（i)小鼠骨髓瘤細(xì)胞株Sp2/0_Agl4(Sp2/0)易培養(yǎng)， 融合率高，是目前最理想的融合細(xì)胞，但要注意該細(xì)胞在過度稀釋（密度低于3XIO5AiL) 和pH堿性（pH>7. 3)條件時會生長不良。（ii)用20%FBSRPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓瘤 細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞數(shù)在104-106/mL時，細(xì)胞呈對數(shù)生長，此時細(xì)胞渾圓透亮、大小均一、邊緣清 晰、排列整齊、呈半致密分布。一般在細(xì)胞處于對數(shù)生長中期時（約IX105-5XIO5AiL)，可 按1:5 - 1:10的比例進(jìn)行稀釋傳代。選處于生長旺盛、形態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞供融合 用。融合骨髓瘤細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)應(yīng)達(dá)95%以上。（iii)融合前將骨髓瘤細(xì)胞從培養(yǎng)瓶移入 離心管，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗3次（lOOOrpm，5min)。用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計 數(shù)。（iv) -般從融合前5天開始復(fù)蘇小鼠骨髓瘤細(xì)胞，每次融合約需6瓶35cm2Sp2/0細(xì) 胞。
[0238] 4、免疫脾細(xì)胞的制備：（i)取待融合的BALB/C小鼠，摘除眼球放血致其死亡，收 集血液制成抗血清，可作為抗體檢測的陽性對照。自來水沖洗小鼠并浸泡于75%乙醇溶液 中5min，隨即放入超凈臺內(nèi)解剖板上，右側(cè)臥位。（ii)打開腹腔取出脾臟，用剪刀將其剪成 小塊放于200目細(xì)胞篩網(wǎng)上，再用研磨棒（注射器內(nèi)芯）擠壓研磨。用吹管滴加RPMI-1640 培養(yǎng)液。（iii)補加適量的RPM-1640培養(yǎng)液，靜置3-5min，取上2/3部分懸液移入50mL塑 料離心管中。上述過程反復(fù)2 - 3次。（iv)用RPMI-1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞3次（1000 rpm離 心IOmin)。（V)用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并計數(shù)。
[0239] 5、使用PEG促融劑融合制備雜交瘤：（i)融合前先將ImL的PEG-1500、IOmL的 RPMI-1640無血清培養(yǎng)基和200mL完全培養(yǎng)基平衡至37°C。（ii)將制備的骨髓瘤細(xì)胞與 脾細(xì)胞混合于50mL離心管內(nèi)（IX108脾細(xì)胞和IX107骨髓瘤細(xì)胞，約10:1)，1500rpm離心 8min，輕輕彈擊管底，使細(xì)胞疏松成糊狀。（iii)吸取0. 8mLPEG加入離心管內(nèi)，在60s內(nèi)加 完，邊加邊輕輕攪拌。隨即加入IOmL預(yù)溫至37°C的RPM-1640完全培養(yǎng)液，溫和攪拌。最 后補加RPMI-1640培養(yǎng)液至40mL，1000 rpm離心5min。（iv)棄上清，取少量HT培養(yǎng)液將 細(xì)胞吹散，之后將準(zhǔn)備好的HT培養(yǎng)液加入。將細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100yL，放 入C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（v)12h后，配置HAT完全培養(yǎng)基，每個孔中滴加100yL。5天后， 用HT完全培養(yǎng)基給孔中的細(xì)胞上清進(jìn)行50-100 %的換液。9-14天后，吸取上清進(jìn)行檢測。
[0240] 6、雜交瘤的篩選：使用間接ELISA篩選，包被重組抗原IOOng/孔，加入細(xì)胞上清 50yL檢測，并挑選出陽性克隆孔。
[0241] 7、雜交瘤細(xì)胞的克隆化：在篩選出的含陽性上清的培養(yǎng)孔中通常是二個以上的雜 交瘤集落。其中有的集落可能不分泌抗體或分泌非實驗所要的抗體，只有其中某一個集落 才是分泌特異抗體的雜交瘤細(xì)胞。因此，須利用克隆培養(yǎng)方法把它們分開，選出所需的雜交 瘤細(xì)胞。最常用的克隆培養(yǎng)方法是有限稀釋法。先把細(xì)胞按一定濃度進(jìn)行梯度稀釋，然后 接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，盡可能使孔內(nèi)只有一個細(xì)胞生長。一般雜交瘤單克隆陽性細(xì)胞 株需要重復(fù)克隆2-3次，直到100%陽性后才算是穩(wěn)定克隆株。得到了穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株 L8F12,其保藏編號為CCTCCN0:C2014101，保藏日期為2014年5月21日，保藏單位為中國 典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏地址為武漢市武昌珞珈山（郵編430072)。
[0242] (3)單抗腹水的誘導(dǎo)
[0243] 1、取BALB/c小鼠2-3只，腹腔注入0. 5mL液體石蠟油。
[0244] 2、1周后，處理對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，1000 rpm離心5min，棄上清液。用無血清 培養(yǎng)液懸浮雜交瘤細(xì)胞，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)至（1-2)X106/mL，每只小鼠腹腔注射0. 5mL。
[0245] 3、7_10天，小鼠腹部明顯膨大后，引頸處死小鼠。將小鼠用自來水沖洗，浸泡于 75%乙醇中5min。使小鼠腹部朝上，用注射針頭將小鼠四肢固定于解剖臺板。用鑷子提起 小鼠腹部皮膚，剪一小口，然后從兩邊向小鼠背部方向剪開，用大鑷子撕開皮膚，充分暴露 腹部。用無菌眼科鑷子提起腹膜，在腹膜中央處剪一小口，然后用ImL吸管通過小口吸出 腹腔內(nèi)全部腹水。將所有腹水混合放入離心管中，3000rpm離心20min，之后收集上清。
[0246] (4)單抗腹水的純化：將腹水用辛酸-飽和硫酸銨沉淀和ProteinA親和層析純 化（購自美國GE公司），獲得純化的單克隆抗體（表9)。
[0247] 表9.單抗信息
[0248]
[0249] (5)單抗的HRP標(biāo)記：操作均在避光條件下進(jìn)行：（i)稱取X mgHRP干粉溶于 x/20mLddH20 中。（ii)稱取ymg(y>x)，溶于y/20mL的ddH20 中。取x/20mL的NaKM溶 液與x/20mL的HRP緩慢混合，4°C下靜置30min。（iii)加入XyL乙二醇，室溫避光靜置 30min。（iv)加入等量體積即（x/20+x/20+0. 05)mLCB(pH9. 6, 50mM)，使溶液的pH值在堿 性條件下。（V)將離心管中的反應(yīng)液移至含抗體的透析袋中，4°CCB透析4h，換液1次。 (vi) x/5mgNaBH4溶于IOxyL的ddH20中并加進(jìn)透析袋，4°C靜置2h，每30min搖動1次。 (vii) 用50%的SAS離心，取沉淀（注意將SAS倒扣干凈，以免殘留的SAS影響抗體）。加 入500yL的緩沖液（50 %甘油和10%NBS)，-20°C保存。
[0250] (6)Anti-C149-2C(aal55_170)小鼠單克隆抗體的性質(zhì)分析
[0251] 1、將實施例2的合成肽分別以Iyg/孔的濃度包被96孔板，37°C2h。洗板1次， 用封閉液（20mMPB7. 4含150MmNaCL，0. 5%酪蛋白，0. 002%明膠）封閉非特異性結(jié)合位 點，37°C2h后抽干。
[0252] 2、將上面得到的抗體酶標(biāo)記物以1:1000稀釋（稀釋液配方同封閉液）后加 100yL，37°C孵育30min。PBST洗板5次，加入顯色液顯色15min，終止液終止，酶標(biāo)儀讀值。 結(jié)果示于圖7。圖7的結(jié)果顯示，單抗L8F12能夠與肽段結(jié)合且具有良好的活性。接下來的 實施例選用L8F12完成。
[0253] 實施例11:抗人腸道病毒廣譜親和表位多肽的單克降抗體與人腸道病毒的結(jié)合 活件
[0254] 將實施例10中的單克隆抗體L8F12對不同代表性的腸道病毒采用免疫熒光進(jìn) 行檢測。免疫熒光方法步驟參照實施例3。結(jié)果證明L8F12能夠交叉結(jié)合JS06-52-3、 TW07-00190、XM08-2035、PV1四種腸道病毒感染的RD細(xì)胞，顯示出綠色熒光，而未感染腸道 病毒的RD細(xì)胞對照則沒有任何反應(yīng)，說明識別2C(aal55-170)表位的L8F12單克隆抗體能 夠特異性交叉結(jié)合不同亞型的腸道病毒（圖8)。這些結(jié)果表明，L8F12是廣譜親和抗體，并 且2C(aal55-170)含有廣譜親和表位。
[0255] 實施例12:抗人腸道病毒廣譜親和表位多肽的單克降抗體用于檢測人腸道病毒 的感染和滴度
[0256] 將實施例10中的單克隆抗體L8F12以梯度稀釋斑點計數(shù)方法檢測腸道病毒的滴 度。本實施例中我們選擇了實施例3中的六種腸道病毒，同時增加了 3352(CA2)、4629(CA9) 和09-3985 (CB2)三個毒株（該三個毒株來源于臺灣CDC)，進(jìn)行感染滴度的測定。具體步 驟見實施例4。本實施例結(jié)果顯示單抗L8F12能夠測定出不同代表性腸道病毒的感染滴度 (圖 9)。
[0257] 上述增加的三種代表性腸道病毒的GenBank登錄號如下：
[0258] 3352(CA2) :JF420570。
[0259] 4629(CA9) ：JQ042702〇
[0260] 09-3985(CB2) ：JQ042701〇
[0261]實施例13:抗人腸道病毒廣譜親和表位多肽的單克降抗體用于檢測人腸道病毒 中和I枯^體效價
[0262] 利用酶聯(lián)免疫斑點法，本實施例中我們將L8F12用于檢測人腸道病毒中和抗體效 價。