蛋白2C的序列片段 時(shí)，其不僅包括SEQIDNO: 10的序列片段，還包括其天然或人工變體中的相應(yīng)序列片段。 例如，表述"腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C的aal55-170"包括，SEQIDNO:10的第155-170位 氨基酸殘基，以及其變體（天然或人工）中的相應(yīng)片段。根據(jù)本發(fā)明，表述"相應(yīng)序列片段" 或"相應(yīng)片段"是指，當(dāng)對(duì)序列進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)時(shí)，即當(dāng)序列進(jìn)行比對(duì)以獲得最高百分?jǐn)?shù)同一 性時(shí)，進(jìn)行比較的序列中位于等同位置的片段。
[0098] 另外，根據(jù)EV71病毒株的完整基因組（FJ600325)可知，腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C 的aa155-170(例如，SEQIDNO: 1所示的序列）對(duì)應(yīng)于由腸道病毒基因組翻譯的氨基酸 序列的aa1266-1281。因此，在本發(fā)明中，表述"腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C的aa155-170" 與表述"由腸道病毒基因組翻譯的氨基酸序列的aa1266-1281"具有等同含義，且可互換使 用。
[0099] 如本文中所使用的，當(dāng)提及HBcAg的氨基酸序列時(shí)，其使用SEQIDNO: 11所示的 序列來進(jìn)行描述。例如，表述"HBcAg的第1-149位氨基酸殘基（aa1-149)"是指，SEQID NO:11所示的多肽的第1-149位氨基酸殘基。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在HBcAg的氨 基酸序列中，可天然產(chǎn)生或人工引入突變或變異（包括但不限于，置換，缺失和/或添加， 例如不同基因型或基因亞型的HBcAg)，而不影響其生物學(xué)功能。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語 "HBcAg"應(yīng)包括所有此類序列，包括例如SEQIDNO:11所示的序列以及其天然或人工的變 體。并且，當(dāng)描述HBcAg的序列片段時(shí)，其不僅包括SEQIDNO:11的序列片段，還包括其天 然或人工變體中的相應(yīng)序列片段。例如，表述"HBcAg的第1-149位氨基酸殘基"包括，SEQ IDNO: 11的第1-149位氨基酸殘基，以及其變體（天然或人工）中的相應(yīng)片段。根據(jù)本發(fā) 明，表述"相應(yīng)序列片段"或"相應(yīng)片段"是指，當(dāng)對(duì)序列進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)時(shí)，即當(dāng)序列進(jìn)行比 對(duì)以獲得最高百分?jǐn)?shù)同一性時(shí)，進(jìn)行比較的序列中位于等同位置的片段。
[0100] 術(shù)語"衍生物"，當(dāng)用于蛋白質(zhì)試劑（包括全長蛋白質(zhì)、多聚體蛋白質(zhì)、多肽、肽、 其抗體和片段以及特別包括表位多肽）的情境中時(shí)，是指具有與第二試劑相似或相同的功 能，但不一定包含與第二試劑相似或相同的氨基酸序列、修飾例如糖基化或二級(jí)、三級(jí)或 四級(jí)結(jié)構(gòu)的試劑。具有相似氨基酸序列的蛋白質(zhì)試劑是指滿足下列至少之一的蛋白質(zhì)試 劑：（a)具有與第二蛋白質(zhì)試劑的氨基酸序列至少30 %、至少35%、至少40 %、至少45 %、 至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、 至少90%、至少95%或至少99%同一的氨基酸序列的蛋白質(zhì)試劑；(b)由在嚴(yán)格條件下與 編碼至少3個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少4個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少 6個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少7個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少8個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少9個(gè)連續(xù) 氨基酸殘基、至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少11個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少12個(gè)連續(xù)氨基 酸殘基、至少13個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少14個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少15個(gè)連續(xù)氨基酸殘 基、至少16個(gè)連續(xù)氨基酸殘基或更多的第二蛋白質(zhì)試劑的核苷酸序列雜交的核苷酸序列 編碼的蛋白質(zhì)試劑；和（c)由與編碼第二蛋白質(zhì)試劑的核苷酸序列至少30%、至少35%、 至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、 至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)試 劑。與第二蛋白質(zhì)試劑具有相似結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)試劑是指具有與第二蛋白質(zhì)試劑相似的二 級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)試劑。多肽的結(jié)構(gòu)可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來測定， 所述方法包括但不限于肽測序、X射線晶體學(xué)、核磁共振、圓二色性和晶體學(xué)電子顯微鏡術(shù) (crystallographicelectronmicroscopy)〇
[0101] 為了測定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的百分比同一性，為了最佳比較目的將 序列進(jìn)行比對(duì)（例如，可在第一氨基酸序列或核酸序列中引入缺口以與第二氨基酸或核酸 序列最佳比對(duì)）。然后比較對(duì)應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)?一序列中的位置被與第二序列中的對(duì)應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則分子在 該位置上是同一的。兩個(gè)序列之間的百分比同一性是由序列所共享的同一性位置的數(shù)目的 函數(shù)（即，百分比同一性=同一重疊位置的數(shù)目/位置的總數(shù)xioo%)。在某些實(shí)施方案 中，兩個(gè)序列長度相同。
[0102] 兩個(gè)序列之間的百分比同一性的測定還可使用數(shù)學(xué)算法來實(shí)現(xiàn)。用于兩個(gè)序 列的比較的數(shù)學(xué)算法的一個(gè)非限制性實(shí)例是Karlin和Altschul的算法，1990,Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87:2264-2268，如同Karlin和Altschul, 1993,Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A. 90:5873-5877中改進(jìn)的。將這樣的算法整合至Altschul等人，1990,J.Mol. Biol. 215:403 的NBLAST和XBLAST程序中。
[0103] 如本文中所用，術(shù)語"衍生物"，在多肽的情境中（包括表位多肽）也指包含已通過 引入氨基酸殘基置換、缺失或添加改變的氨基酸序列的多肽或肽。如本文中所用，術(shù)語"衍 生物"還指已被修飾（即，通過將任何類型的分子共價(jià)連接至多肽或肽）的多肽或肽。例如， 但非限制性地，多肽可以被修飾，例如通過糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通 過已知保護(hù)/封閉基團(tuán)進(jìn)行的衍生化、蛋白水解切割、連接至細(xì)胞配體或其它蛋白質(zhì)等。衍 生多肽或肽可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)通過化學(xué)修飾來產(chǎn)生，所述技術(shù)包括但不限 于特異性化學(xué)切割、乙酰化、甲?；?、衣霉素的代謝合成等。此外，衍生多肽或肽衍生物具有 與其所源自的多肽或肽相似、相同或改善的功能。
[0104] 如本文中所用，"衍生物"與"變體"可互換地使用。
[0105] 如本文中所用，術(shù)語"片段"是指這樣的肽或多肽，所述肽或多肽包含另一個(gè)多肽 的氨基酸序列的至少3個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少4個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少5個(gè)連續(xù)氨基酸 殘基、至少6個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少7個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少8個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少 9個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少10個(gè)連續(xù)氨基酸、至少11個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少連續(xù)12個(gè)氨 基酸殘基、至少連續(xù)13個(gè)氨基酸殘基、至少連續(xù)14個(gè)氨基酸殘基、至少連續(xù)15個(gè)氨基酸殘 基、至少16個(gè)連續(xù)氨基酸殘基、至少連續(xù)20個(gè)氨基酸殘基、至少連續(xù)25個(gè)氨基酸殘基、至 少連續(xù)30個(gè)氨基酸殘基或更多的氨基酸序列。在具體的實(shí)施方案中，多肽的片段保持多肽 的至少一種功能。
[0106]如本文中所用，術(shù)語"重鏈"、"輕鏈"、"可變區(qū)"、"框架區(qū)"、"恒定區(qū)"等具有它們在 免疫學(xué)領(lǐng)域中的普通含義，并且是指天然存在的免疫球蛋白中的結(jié)構(gòu)域和合成（例如，重 組）結(jié)合蛋白（例如，人源化抗體、單鏈抗體、嵌合抗體等）的對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)域。天然存在的免疫 球蛋白（例如，IgG)的基本結(jié)構(gòu)單元是具有2個(gè)輕鏈（L)和2個(gè)重鏈（H)的四聚體，通常表 達(dá)為約150,OOODa的糖蛋白。每一條鏈的氨基末端（"n"）部分包括主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的約 100至110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。每一條鏈的羧基末端（"c"）部分定義恒定區(qū)，輕鏈 具有單個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域，重鏈通常具有3個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)。因此，每一個(gè)輕鏈通常由可 變結(jié)構(gòu)域（VL)和恒定結(jié)構(gòu)域（CL)構(gòu)成；而每一個(gè)重鏈通常包括可變結(jié)構(gòu)域（VH)和3個(gè)恒 定結(jié)構(gòu)域（CH1、CH2和CH3)以及鉸鏈區(qū)⑶。因此，免疫球蛋白分子例如IgG的輕鏈的結(jié)構(gòu) 為n-\-Q-c并且免疫球蛋白分子例如IgG的重鏈的結(jié)構(gòu)為n-VH-Cm-H-CH2-CH3-C (其 中H為鉸鏈區(qū)）?？贵w或抗體片段的可變區(qū)包括互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)(其包含與抗原接觸的殘 基），和非CDR區(qū)段（稱為框架區(qū)段或框架區(qū)（FR或FwR)，其通常維持CDR環(huán)的結(jié)構(gòu)和確定 其定位（盡管某些框架殘基也可接觸抗原））。因此，\和V"結(jié)構(gòu)域具有結(jié)構(gòu)n-FRl，⑶R1， FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4-C。
[0107]抗體片段可從完整的常規(guī)IgG產(chǎn)生，并包括抗原結(jié)合片段、Fc結(jié)構(gòu)域、Fab片段 (F(ab))、F(ab'）片段、單鏈Fv片段（scFv) (VH-VL二聚體）、僅重鏈結(jié)構(gòu)域、僅輕鏈結(jié)構(gòu)域、 以及單個(gè)（單一）結(jié)構(gòu)域，例如，VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域、(^結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域、 CL結(jié)構(gòu)域等。
[0108]術(shù)語"抗體單結(jié)構(gòu)域"、"單結(jié)構(gòu)域抗體"或"sdAb"是指包含抗體的VH或VL結(jié)構(gòu) 域或由所述結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段，即單個(gè)單聚體可變抗體結(jié)構(gòu)域。像完整抗體一樣，抗體 單結(jié)構(gòu)域可免疫特異性地結(jié)合特定抗原。然而，與完整抗體不同，抗體單結(jié)構(gòu)域不顯示補(bǔ)體 系統(tǒng)觸發(fā)的細(xì)胞毒性，因?yàn)樗鼈內(nèi)鄙貴c區(qū)域。兩個(gè)或更多個(gè)抗體單結(jié)構(gòu)域可組合以產(chǎn)生二 聚體及其更高級(jí)的結(jié)構(gòu)。
[0109]如本文中所用，術(shù)語"免疫特異性結(jié)合"、"免疫特異性識(shí)別"、"特異性結(jié)合"、"特異 性識(shí)別"和類似術(shù)語是指在生理?xiàng)l件下特異性結(jié)合抗原（例如，表位多肽或表位多肽的融 合蛋白）并且不特異性結(jié)合另一種分子的分子。可以例如通過免疫測定、BIAcore或本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的其它技術(shù)來鑒定特異性結(jié)合抗原的分子。特異性結(jié)合抗原的分子可以以 更低的親和力（如通過例如免疫測定、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法、BIAcore或本領(lǐng)域已知的其它測定 確定的）結(jié)合其它肽或多肽。在一些實(shí)施方案中，特異性結(jié)合抗原的分子與其它分子（例 如來自其它物種的類似蛋白質(zhì)）交叉反應(yīng)。
[0110]如本文中所用，術(shù)語"核酸"和"核苷酸序列"包括DNA分子（例如，cDNA或基因組 DNA)、RNA分子（例如，mRNA)、DNA與RNA分子的組合或雜交DNA/RNA分子，以及DNA或RNA 分子的衍生物。這樣的衍生物可使用例如核苷酸（其包括但不限于肌苷或三苯甲基化的堿 基）來產(chǎn)生。這樣的衍生物還可包括含有經(jīng)修飾的主鏈的DNA或RNA分子，所述經(jīng)修飾的 主鏈給分子提供了有益的特性，例如核酸酶抗性或增強(qiáng)的穿過細(xì)胞膜的能力。核酸或核苷 酸序列可以是單鏈、雙鏈的，可包含單鏈和雙鏈部分，并且可包含三鏈部分，但優(yōu)選是雙鏈 DNA0
[0111] "分離的"或"純化的"分子大體上不含來自分子所源自的細(xì)胞或組織來源的細(xì)胞 材料或其它污染物，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)，大體上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品。語言"大體上不 含細(xì)胞材料"包括下述分子制劑，其中分子與其所從中分離或重組產(chǎn)生的細(xì)胞的細(xì)胞組分 分離。因此，大體上不含細(xì)胞材料的蛋白質(zhì)包括具有少于約30%、20%、10%或5%(按干 重計(jì)）的污染性蛋白質(zhì)的制劑。當(dāng)重組地產(chǎn)生分子（通常為蛋白質(zhì)）時(shí)，其通常也大體上 不含培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基代表少于約30%、20%、10%或5%的制劑體積。當(dāng)分子通過化學(xué)合 成產(chǎn)生時(shí)，其通常大體上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品，即，其與化學(xué)前體或參與分子合成的 其它化學(xué)品是分離的。因此，這樣的制劑具有少于約30%、20%、10%、5%(按干重計(jì)）的 化學(xué)前體或除目標(biāo)分子外的化合物。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，多肽、蛋白質(zhì)，特別是融 合蛋白是分離的或純化的。
[0112]如本文中所用，術(shù)語"受試者"、"宿主"和"患者"可互換地使用。受試者通常是哺 乳動(dòng)物例如非靈長類動(dòng)物（例如，牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等）或靈長類動(dòng)物（例如，猴和 人），最通常為人。所述"受試者"可以指患者或者其它接受本發(fā)明的產(chǎn)品和/或方法以治 療、預(yù)防、減輕、緩解和/或診斷、鑒定本申請所述疾病或病癥的動(dòng)物。
[0113]術(shù)語"廣譜親和表位多肽"是指識(shí)別該表位多肽區(qū)段的單抗或多抗血清能夠與不 同基因型或血清型的人腸道病毒結(jié)合。
[0114]術(shù)語"調(diào)控序列"定義為包括表達(dá)本發(fā)明的抗原表位所必需或有利的所有組分。每 個(gè)調(diào)控序列對(duì)于編碼多肽（抗原表位）的核酸序列可以是天然含有的或外來的。這些調(diào)控 序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)序列和轉(zhuǎn)錄終 止子。最低限度，調(diào)控序列要包括啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號(hào)。為了導(dǎo)入特定的限 制位點(diǎn)以便將調(diào)控序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)進(jìn)行連接，可以提供帶接頭的調(diào)控 序列。術(shù)語"可操作連接"在文中定義為這樣一種構(gòu)象，其中調(diào)控序列位于相對(duì)DNA序列之 編碼序列的適當(dāng)位置，以使調(diào)控序列指導(dǎo)多肽的表達(dá)。
[0115]術(shù)語"宿主細(xì)胞"涵蓋任何由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的后代。宿 主細(xì)胞的選擇很大程度上取決于多肽編碼基因及其來源。
[0116]術(shù)語"廣譜親和單克隆抗體"是指由淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的、只針對(duì)復(fù)合抗原分子 上某一單個(gè)抗原決定簇的特異性抗體，并且能與不同基因型或血清型的人腸道病毒結(jié)合。
[0117] 在本申請中，術(shù)語"結(jié)合"具有免疫學(xué)的一般含義，例如抗原抗體間的結(jié)合。
[0118] 在本申請中，術(shù)語"有效量"是指可在受試者中實(shí)現(xiàn)治療、預(yù)防、減輕和/或緩解本 發(fā)明所述疾病或病癥的劑量。
[0119]術(shù)語"疾病和/或病癥"是指所述受試者的一種身體狀態(tài)，該身體狀態(tài)與本發(fā)明所 述疾病和/或病癥有關(guān)。
【附圖說明】
[0120] 圖1:位于人腸道病毒蛋白2C內(nèi)的氨基酸序列AOl(腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋 白2C的aa155-170,對(duì)應(yīng)于由腸道病毒基因組翻譯的氨基酸序列的aa1266-1281): YSLPH)roHFDGYKQQ(SEQIDN0:1)、位于人腸道病毒蛋白3C內(nèi)的氨基酸序列A02(腸道 病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3C的aa159-166,對(duì)應(yīng)于由腸道病毒基因組翻譯的氨基酸序列的aa 1707-1714) :GIHIGGNG、位于人腸道病毒蛋白3D內(nèi)的氨基酸序列A03(腸道病毒非結(jié)構(gòu) 蛋白3D的aa297-307,對(duì)應(yīng)于由腸道病毒基因組翻譯的氨基酸序列的aa2028-2038):FNSMINNIIIR的保守性分析圖。
[0121] 圖2 :顯示針對(duì)PA01、PA02和PA03多肽的抗血清對(duì)感染腸道病毒的RD細(xì)胞的免 疫熒光圖。
[0122] 圖3 :C149_2C(aa 155-170)的質(zhì)粒構(gòu)建流程圖和質(zhì)粒示意圖。
[0123]圖 4:顯示蛋白C149 和C149-2C(aal55-170)的SDS-PAGE電泳圖（泳道 1、2)，其 中，泳道1的樣品為純化的C149蛋白；泳道2的樣品為純化的C149-2C(aal55-170)融合蛋 白；泳道M為蛋白質(zhì)Marker。
[0124] 圖5 :C149-2C(aal55_170)和C149重組蛋白組裝的類病毒顆粒的電鏡圖（放大 25, 000倍）。其中，圖A的樣品為由蛋白C149組裝的類病毒顆粒；圖B的樣品為由融合蛋 白C149-2C(aal55-170)組裝的類病毒顆粒。
[0125] 圖6:顯示C149-2C(aal55_170)融合蛋白抗血清對(duì)感染腸道病毒的RD細(xì)胞的免 疫熒光圖。
[0126] 圖7 :顯示篩選到的單克隆抗體L8F12稀釋1000倍后與合成多肽2C(aal55_170) 之間的結(jié)合親和力的ELISA檢測值OD(450/620)的強(qiáng)度矩形圖。
[0127] 圖8:顯示單抗L8F12對(duì)感染腸道病毒的RD細(xì)胞的免疫熒光圖。
[0128] 圖9:顯示單抗L8F12通過ELISP0T檢測被病毒感染的RD細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)。
[0129] 圖10:顯示單抗L8F12通過免疫組織化學(xué)法檢測被病毒感染的動(dòng)物組織，檢測的 組織部位包括大腦、脊髓和肌肉。
[0130] 序列信息
[0131] 本申請涉及的序列的描述提供于表1中。
[0132]表1
[0133]
[0134] 關(guān)于生物材料保藏的說明
[0135] 本發(fā)明涉及下列已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC，中國武漢，武漢大學(xué)）進(jìn) 行保藏的生物材料：雜交瘤細(xì)胞株L8F12,其具有保藏號(hào)CCTCCN0:C2014101，且保藏時(shí)間 為2014年5月21日，保藏地址為武漢市武昌珞珈山（郵編430072)。 具體實(shí)施方案
[0136] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理 解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)被視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具 體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件（例如參考J.薩姆布魯克等 著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社）或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。 所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0137]實(shí)施例1:人腸道病毒高保守多肽的設(shè)計(jì)
[0138] 本實(shí)施例對(duì)不同血清型的人腸道病毒基因組氨基酸序列采用Clustal軟件進(jìn)行 同源性分析。使用的毒株序列包括EV71、CVA16、CVA2、CVB3、E30等共65株病毒，具體信息