agents)等可以加入到組合物 中。
[0077] 在任何情況中，本領(lǐng)域技術(shù)人員會保證對這些添加劑以及其量進(jìn)行選擇以使之 不破壞本發(fā)明的組合物的希望的有利性質(zhì)。例如，這些添加劑可以相應(yīng)于組合物總重量的 0. 01-20%。當(dāng)本發(fā)明組合物是乳液時，脂肪相基于組合物的總重量可以是5-80% (重量）、 優(yōu)選5-50% (重量）。組合物中使用的乳化劑和共乳化劑從相關(guān)領(lǐng)域常規(guī)使用的那些中選 擇。例如，它們可以以基于組合物總重量為0.3-30% (重量）的比例使用。
[0078] 本發(fā)明的第三個目的涉及所述肽化合物用作Clock激活物活性成分。"Clock激活 物"肽意味著能夠增加Clock活性的任何生物學(xué)活性肽或衍生物，其通過增加Clock蛋白合 成（通過直接或間接調(diào)節(jié)Clock基因表達(dá)）或者通過其它生物學(xué)過程如Clock蛋白的穩(wěn)定 化或者RNA信使轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定化。
[0079] 本發(fā)明的另一個目的涉及使用本發(fā)明的組合物以恢復(fù)晝夜節(jié)律及再同步皮膚細(xì) 胞的生物鐘。
[0080] 本發(fā)明的一個具體實施方案是使用組合物激活細(xì)胞更新及刺激細(xì)胞代謝。更具體 地，本發(fā)明包括使用組合物降低由飛行時差和/或夜班工作導(dǎo)致的功能障礙。本發(fā)明有利 地涉及在組合物中使用所述肽化合物以遵循皮膚時間生物學(xué)，特別是應(yīng)用夜間化妝處理形 式。
[0081] 本發(fā)明另一個實施方案包括使用組合物預(yù)防或者治療衰老的皮膚跡象。"衰老 的皮膚跡象"包括但不限于由衰老導(dǎo)致的皮膚上的任何可見表現(xiàn)。具體地，這意味著皺 紋、細(xì)紋（finelines)、皮膚皸裂（chappedskin)、毛孔增大、瑕疵、緊度喪失（lossesin firmness)、褪色、衰老區(qū)域、角化病、膠原喪失、真皮和表皮的其他改變等。"衰老的皮膚跡 象"也意味著由衰老導(dǎo)致的皮膚和皮膚附件外觀的任何改變，如角質(zhì)層的表面粗糙、細(xì)紋和 皺紋，以及未系統(tǒng)地表現(xiàn)為改變的外觀的任何皮膚內(nèi)部改變，如真皮變薄或者暴露于紫外 (UV)照射之后皮膚的任何其他內(nèi)部退化。更具體地，本發(fā)明涉及使用上述組合物以降低皮 膚疲勞跡象。
[0082] 本發(fā)明進(jìn)一步的目的涉及使用有效量的本發(fā)明的肽活性成分以制備用于預(yù)防或 者對抗與晝夜節(jié)律功能障礙相關(guān)的病變的組合物。
[0083] 本發(fā)明最后一個目的涉及化妝處理方法，其特征在于將含有有效量的肽活性成分 的組合物局部施用于皮膚或皮膚附件，以恢復(fù)晝夜節(jié)律及再同步細(xì)胞的生物鐘。
[0084] 另外，這種化妝處理方法特征在于為了具有皮膚抗衰老作用，所述組合物在睡覺 前施用以遵守皮膚的晝夜節(jié)律。事實上，在夜間，皮膚促進(jìn)更新功能以及代謝合成過程。因 此，通過遵守皮膚的生物學(xué)節(jié)律，所述組合物的施用使得可以獲得抗衰老作用（其刺激細(xì) 胞更新）以及再生作用（其因此降低衰老跡象）。
[0085] 下述實施例描述和證實本發(fā)明所述肽化合物的功效。所述化妝品配制物是本發(fā)明 的代表但是僅僅是舉例，不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。
[0086] 實施例1 :證實肽SEQIDNO:1、SEQIDN0 :2和SEQIDN0 :3對培養(yǎng)的成纖維細(xì) 胞中Clock蛋白的表達(dá)的激活作用
[0087] 通過在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中經(jīng)western印跡評估Clock蛋白的表達(dá)而進(jìn)行肽SEQ IDNO:1、SEQIDN0 :2和SEQIDN0 :3的激活作用研究。Western印跡技術(shù)是半定量方法， 其使得可以評估細(xì)胞中的Clock蛋白水平。
[0088] 方案：
[0089] 在（從 10-4M溶液）稀釋至 1% 的肽SEQIDN0 :1、SEQIDN0 :2 和SEQIDN0 : 3的存在或不存在下，將培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞在直徑100mm的容器中在含有5 %C02的濕 潤空氣中在37°C培養(yǎng)18小時。漂洗細(xì)胞，然后用提取緩沖液（20mMTRIS，150mMNaCl， 10mMEDTA，0. 2%tritonX10)在蛋白酶抑制劑混合物（Sigma)存在下從支持物上取下。 由此提取的蛋白質(zhì)在4°ClOOOOrpm離心10分鐘，之后用BCA蛋白定量（dosing)試劑盒 (Pierce)定量。細(xì)胞裂解物與變性緩沖液混合并進(jìn)行SDS-PAGE電泳。所用凝膠是4-12% Nupage(Invitrogen)。蛋白質(zhì)然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（Palcorporation)。膜在環(huán)境溫 度下于5%PBS-乳和(λ1%tween20中飽和2小時，然后在4°C與1/1000稀釋的抗Clock 一抗（Abeam)保溫過夜，之后與稀釋1/5000的抗兔二抗Iggy-過氧化物酶保溫。經(jīng)化學(xué)發(fā) 光底物進(jìn)行觀測。細(xì)胞中存在的蛋白質(zhì)的定量評估用chemiimager軟件（Alphainnotech CorporationUSA)進(jìn)行。蛋白質(zhì)的量表示為與未接受處理的對照條件相比的發(fā)光強度百分 比。
[0090] 結(jié)果：
[0091]Western印跡獲得的結(jié)果顯示用稀釋至1%的肽SEQIDNO:1、SEQIDN0 :2和SEQ IDNO:3處理顯著增加培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中的Clock蛋白的量。結(jié)果總結(jié)于下表1。
[0092] 表 1
[0093]
[0094] 結(jié)論：
[0095] 肽SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3使得可以增加培養(yǎng)的真皮細(xì)胞中 的Clock蛋白的表達(dá)。
[0096] 實施例2 :證實肽SEQIDN0 :1、SEQIDN0 :2和SEQIDN0 :3對皮膚活組織檢 查樣品中的Clock、Per-Ι和BMAL-1蛋白的表達(dá)的激活作用
[0097] 通過評估離體皮膚活檢樣品中Clock、Per-l和BMAL-1蛋白的表達(dá)進(jìn)行肽SEQID NO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的激活作用的研究。
[0098] 方案：
[0099] 通過免疫標(biāo)記的離體研究使得可以顯示皮膚樣品中的Clock、Per-Ι和BMAL-1蛋 白的表達(dá)。人類皮膚樣品在氣/液界面培養(yǎng)。稀釋至1 % (從10-4M溶液）的肽SEQID NO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3局部施加于這些樣品48小時。
[0100] 未用肽SEQIDN0:1、SEQIDN0:2和SEQIDN0:3處理的皮膚樣品用作對照。皮 膚樣品用10%甲醛固定并包埋在石蠟中。用切片機制備3μπι切片。在除去石蠟并暴露抗 原位點之后進(jìn)行免疫標(biāo)記。通過稀釋1/250的抗體（Abeam)和稀釋1/50并偶聯(lián)于熒光染 料的二抗進(jìn)行Clock蛋白的免疫標(biāo)記。
[0101] 通過稀釋1/100的多克隆抗體（Cosmobio)和稀釋1/50并偶聯(lián)于熒光染料的二抗 進(jìn)行Per-Ι蛋白的免疫標(biāo)記。
[0102] 通過稀釋1/120的多克隆抗體（AvivaSystemsBiology)和稀釋1/50并偶聯(lián)于 熒光染料的第二抗體進(jìn)行BMAL-1蛋白的免疫標(biāo)記。
[0103] 玻片然后在合適介質(zhì)中封固并在表面焚光顯微鏡（NikonEclipseE600)下觀測。
[0104] 結(jié)果：
[0105] 獲得的結(jié)果顯示用肽SEQIDN0 :1、SEQIDN0 :2和SEQIDN0 :3處理的皮膚 Clock、PER-l和BMAL-1蛋白的表達(dá)量大于未處理皮膚的表達(dá)量。
[0106] 標(biāo)記的半定量評估通過顯微鏡觀測進(jìn)行并總結(jié)于下表2。
[0107] 表 2
[0108]
[0109] 結(jié)論：
[0110] 施用肽SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3可以增加被照射和處理的皮 膚中Clock、PER-l和BMAL-1蛋白的表達(dá)。
[0111] 實施例3 :證實肽SEQIDNO:1、SEQIDN0 :2和SEQIDN0 :3對衰老過程中皮膚 生物活組織檢查樣品中的Clock蛋白的表達(dá)的激活作用
[0112] 通過評估在培養(yǎng)期間人工老化的皮膚模型中的Clock蛋白的表達(dá)進(jìn)行肽SEQID NO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的激活作用研究。在培養(yǎng)65小時和138小時之后進(jìn)行 分析。
[0113] 方案：
[0114] 通過免疫標(biāo)記的離體研究使得可