以顯示在培養(yǎng)期間老化的皮膚樣品中的Clock 蛋白的表達(dá)。人類皮膚樣品在氣/液界面培養(yǎng)65小時和138小時。稀釋至1% (從10-4M 溶液）的肽SEQIDN0:1、SEQIDN0:2和SEQIDN0:3在實驗期間以每天2次局部施加 于這些樣品。
[0115] 未用肽SEQIDNO:1、SEQIDN0 :2和SEQIDN0 :3處理的皮膚樣品用作對照。皮 膚樣品用10%甲醛固定并包埋在石蠟中。用切片機制備3μL?切片。在除去石蠟并暴露抗 原位點之后進行標(biāo)記標(biāo)記。通過稀釋1/250的抗兔抗體（Abeam)和稀釋1/50并偶聯(lián)于熒 光染料的二抗進行Clock蛋白的免疫標(biāo)記。
[0116] 玻片然后在合適介質(zhì)中封固并在表面焚光顯微鏡（NikonEclipseE600)下觀測。
[0117]結(jié)果：
[0118] 獲得的結(jié)果顯不Clock蛋白的標(biāo)記（主要在表皮）在培養(yǎng)65小時后與未處理對 照玻片相比增加。這個標(biāo)記隨時間持續(xù)，因為138小時之后Clock蛋白的標(biāo)記與未處理對 照皮膚相比大大增加。下表3給出標(biāo)記的目視評估。
[0119] 表 3
[0120]
[0121] 結(jié)論：
[0122] 施用肽SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3使得可以增加在培養(yǎng)過程中 人工老化的處理的皮膚活組織檢查樣品中的Clock蛋白的表達(dá)。
[0123] 實施例4 :證實在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞上肽SEQIDN0 :1、SEQIDN0 :2和SEQID NO:3的抗衰老作用
[0124] 通過在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞上短期和長期評估β-半乳糖苷酶活性而進行肽SEQID NO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的抗衰老作用研究。事實上，β-半乳糖苷酶已知存 在于衰老細(xì)胞中，而β-半乳糖苷酶活性在衰老前、休眠的或永生化細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)。
[0125]方案：
[0126] 在8孔Labteck中培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞在稀釋至1 % (從10-4Μ溶液）的肽SEQID NO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的存在或不存在下保持2周（短期作用）或7周（長 期作用）。處理每天進行一次。
[0127] 未處理的但是根據(jù)實驗要求保持培養(yǎng)2周或7周的細(xì)胞用作對照。在標(biāo)記 當(dāng)天，漂洗細(xì)胞，在混合物（2%戊二醛-2%甲醛）中固定3分鐘。漂洗細(xì)胞并加入 300μ1 (5-溴-4-氯-3吲哚基-β-D-半乳糖苷酶），其通常稱為X-gal(β-半乳糖苷酶的 底物）。在溫箱中在C02存在下保溫24小時，然后漂洗細(xì)胞并將Labteck迅速置于合適介質(zhì) 中。在透射顯微鏡下進行觀測。原理很簡單：當(dāng)細(xì)胞衰老并含有β-半乳糖苷酶時，X-gal 底物被裂解為藍(lán)色不溶性產(chǎn)物。
[0128]結(jié)果：
[0129] 通過藍(lán)色著色而在未處理的對照細(xì)胞中測量到半乳糖苷酶活性。半乳糖 苷酶活性在用肽SEQIDN0:1、SEQIDΝ0:2和SEQIDΝ0:3處理的細(xì)胞中被大大降低。在 短期（2周實驗）處理的細(xì)胞中以及在長期處理的細(xì)胞（即細(xì)胞被處理連續(xù)7周）中均觀 測到該作用。
[0130] 施用肽SEQIDΝ0 :1、SEQIDΝ0 :2和SEQIDΝ0 :3使得可以在人工老化2或7 周的培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞上顯示抗衰老作用。
[0131] 實施例5:制備抗衰老乳霜（cream)
[0132]


[0135] 程序：
[0136] 制備并熔化A相至65-70°C。加熱C相至65-70°C。僅在將A相在B相中乳化之 前將B相加入到A相。在大約45°C通過加入D相中和卡波姆。然后輕微振蕩下加入E相， 然后進行冷卻至25°C。然后如果需要加入F相。
【主權(quán)項】
1. 式（I)表示的抗衰老肽化合物， Rj- (AA) m-Thr-Ser-Thr-Pr〇-Ser- (AA) n-R2 (I)； 其中， AA是除了脯氨酸或者其衍生物之外的任意氨基酸，以及m和n是0-4之間的整數(shù)； 札是~末端氨基酸的伯胺官能團，其是游離的或者由保護基團取代，所述保護基團可以 選自乙酰基團、苯甲?；鶊F、甲苯磺?；鶊F或者芐氧基羰基基團； 私是(：末端氨基酸的羧基官能團的羥基基團，其由保護基團取代，所述保護基團可選自CfC2。烷基鏈或者ΝΗ2、ΝΗΥ或者ΝΥΥ基團，其中Υ是(；-(：4烷基鏈； 所述通式（I)的序列由5-13個氨基酸殘基組成； 所述通式（I)的序列具有恢復(fù)晝夜節(jié)律及再同步皮膚細(xì)胞的生物鐘的功能。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽化合物，其特征在于，其通過氨基末端的乙?；槐Ｗo。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的肽化合物，其特征在于，其具有下列任一所示的氨基酸序 列： Thr-Ser-Thr-Pr〇-Ser-Glu-NH2 (SEQ ID ΝΟ：1)；Thr-Ser-Thr-Pr〇-Ser-His-Glu-NH2(SEQ ID NO：2)； Thr-Ser-Thr-Pr〇-Ser-Leu-His-Val-NH2(SEQ ID NO：3)； Thr-Ser-Thr-Pr〇-Ser-Asn-Asp-Leu-Ile-NH2 (SEQ ID NO：4)； Ala-Thr-Ser-Thr-Pr〇-Ser-Gly-NH2(SEQ ID NO：5)； Met-Phe-Thr-Ser-Thr-Pr〇-Ser-Glu-His-NH2(SEQ ID NO：6)； Gln-Cys-Gly-Trp-Thr-Ser-Thr-Pr〇-Ser-Gly-Arg-NH2(SEQ ID NO：7)〇4. 一種化妝品組合物，其特征在于，所述化妝品組合物以權(quán)利要求1至3任一項所述的 肽化合物為活性成分。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的化妝品組合物，其特征在于，所述活性成分是單一肽化合物 或兩種以上肽化合物的混合物。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的化妝品組合物，其特征在于，所述化妝品組合物還包含化 妝品學(xué)上可接受的介質(zhì)。7. 根據(jù)權(quán)利要求4至6任一項所述的化妝品組合物，其特征在于，所述活性成分溶解于 一或多種溶劑中； 優(yōu)選地，所述溶劑是水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、一縮二丙二醇、乙氧基化二甘醇或 者丙氧基化二甘醇、環(huán)狀多元醇、凡士林油、植物油或者這些溶劑的任何混合物。8. 根據(jù)權(quán)利要求4至7任一項所述的化妝品組合物，其特征在于，所述活性成分在所述 化妝品組合物中的濃度是〇· 001-200ppm、優(yōu)選0· 01-2ppm。9. 根據(jù)權(quán)利要求4至8任一項所述的化妝品組合物，其特征在于，所述化妝品組合物進 一步含有促進所述肽化合物的活性成分作用的至少一種其它活性成分； 優(yōu)選地，所述其它活性成分選自肽活性劑、植物提取物、愈合劑、抗衰老劑、抗皺劑、安 撫劑、抗輻射劑、抗氧化劑、抗UV劑、真皮大分子合成的刺激劑或者能量代謝的刺激劑、水 合劑、抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、抗炎劑、麻醉劑、調(diào)節(jié)皮膚分化、色素沉著或者色素脫失的制劑、 指甲或毛發(fā)生長的刺激劑。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的化妝品組合物，其特征在于，所述其它活性成分選自抗輻射 或者抗氧化劑或者真皮大分子合成的刺激劑或者能量代謝的刺激劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗衰老肽化合物、其組合物及應(yīng)用。該抗衰老肽化合物具有R1-(AA)m-Thr-Ser-Thr-Pro-Ser-(AA)n-R2所示的氨基酸序列；其中，AA是除了脯氨酸或者其衍生物之外的任意氨基酸，以及m和n是0-4之間的整數(shù)；R1是N末端氨基酸的伯胺官能團；R2是C末端氨基酸的羧基官能團的羥基基團，其由保護基團取代，所述保護基團可選自C1-C20烷基鏈或者NH2、NHY或者NYY基團，其中Y是C1-C4烷基鏈；所述通式(I)的序列由5-13個氨基酸殘基組成；所述通式(I)的序列具有恢復(fù)晝夜節(jié)律及再同步皮膚細(xì)胞的生物鐘的功能。
【IPC分類】C07K7/08, A61Q19/00, A61Q19/08, A61K8/64, C07K7/06, C07K1/06
【公開號】CN105461784
【申請?zhí)枴緾N201410394846
【發(fā)明人】李飛
【申請人】無錫成博科技發(fā)展有限公司
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2014年8月12日