具有低可提取物的高容量復(fù)合深層過濾介質(zhì)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明整體上涉及高容量深層過濾介質(zhì)，其具有減少的使用前沖洗要求，以及增 加的對包含生物產(chǎn)物的進料流中所含的宿主細胞蛋白和其他可溶性雜質(zhì)的結(jié)合能力。更具 體地，其涉及用于澄清細胞培養(yǎng)/生物進料流的高容量深層過濾裝置，所述裝置利用多孔深 層過濾介質(zhì)，所述介質(zhì)并入具有足夠表面積和吸附特性的無機助濾劑以從所述進料流提取 可溶性雜質(zhì)，并且還表現(xiàn)出顯著較低的沖洗要求，導(dǎo)致沖洗之后從深層過濾介質(zhì)釋放的有 機可提取物的水平較低。
【背景技術(shù)】
[0002] 深層過濾常用于細胞培養(yǎng)物的澄清。顧名思義，深層濾器利用其深度或厚度進行 過濾。濾器通常是具有梯度密度結(jié)構(gòu)的材料，一般在靠近頂部具有較大的孔，而在底部具有 較小的孔。不像絕對濾器，深層濾器在整個多孔介質(zhì)保留顆粒，允許保留大于和小于孔徑的 顆粒。據(jù)認為顆粒保留包括通過疏水、離子和其他相互作用來大小排阻和吸附。深層濾器的 污染機制可以包括孔阻塞、團塊形成和/或孔收縮。
[0003] 在許多情況下，深層濾器可以串聯(lián)運行，從而在第一過濾階段去除大部分較粗糙 的顆粒，而較細的顆粒在第二階段中濾掉。因此，在其中有廣泛的粒徑分布(如從細胞和細 胞碎片）的細胞培養(yǎng)物中，深層濾器意圖保留大部分的懸浮顆粒。
[0004]傳統(tǒng)深層介質(zhì)由以下組成：（1)纖維素，（2)硅藻土 (DE)或其他助濾劑，以及（3)濕 強樹脂。但是，這些材料可以包含痕量的可以提取入含水過程流的β葡聚糖、金屬和生物負 荷。
[0005] 在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中，這些污染物是不可取的，并且可以潛在干擾純化方案，以及與 產(chǎn)物分子負相互作用或超過產(chǎn)業(yè)建立的典型驗收標準。例如，已顯示后來鑒定為β葡聚糖的 提取自纖維素纖維濾器的材料在鱟試驗(LAL)測試中導(dǎo)致內(nèi)毒素的假陽性(Pear S〇n，F(xiàn).C.， et al 1984Applied and Environmental Biology 48:1189-1196)。在某些情況下，最終產(chǎn) 物中高水平的鋁離子可以對人神經(jīng)系統(tǒng)有神經(jīng)毒性作用。
[0006] 在使用之前，深層濾器需要大量預(yù)沖洗，通常用含水溶液如水，以便將有機和無機 污染物的水平降低至可接受的值。
[0007] 為了減少生物負荷，深層濾器可以用堿性消毒劑（caustic sanitant)如0 · 5N NaOH 預(yù)處理 30min。
[0008] 減少深層濾器生物負荷的另一方法是使深層濾器進行輻射處理如γ輻照。
[0009] 減少深層濾器生物負荷的另一方法是通過高壓滅菌或在線蒸汽，其中使包含深層 濾器組件的整個過濾裝置接受高壓下的蒸汽。雖然這些方法可以減少生物負荷，但是它們 經(jīng)常對可提取物有負面影響。
[0010] 此外，天然存在的材料硅藻土(DE)是金屬可提取物的主要來源，并且因為DE是天 然存在的材料，其組成有大可變性，取決于DE采自哪里。雖然用酸預(yù)處理DE可以減少金屬可 提取物，但是其還增加額外的加工步驟。其他基于二氧化硅的助濾劑如珍珠巖或沙在這方 面也受到限制。
[0011] 活性炭助濾劑通常源自天然材料如木材或椰子殼，其組成也有相當大的變化。
[0012] 來自纖維素/DE深層濾器的可提取物還可以源自構(gòu)建材料本身，如來自纖維脫落 或過濾期間的顆粒。雖然濕強樹脂一般有助于將纖維和DE "膠合"或粘附在一起，但是不可 避免地有一部分顆粒容易從深層濾器釋放。實際上，纖維素/DE介質(zhì)片可以從來回扇過濾片 的簡單動作產(chǎn)生一團顆粒。
[0013] 過濾受到積累顆粒的可用體積，即污垢容納能力的限制。傳統(tǒng)深層濾器傾向于具 有低污垢容納能力，因為濾器的大部分體積被纖維和助濾劑占據(jù)。深層過濾介質(zhì)還可以迅 速堵塞并導(dǎo)致團塊層的累積。
[0014] 此外，目前可用的深層過濾介質(zhì)在加工細胞培養(yǎng)物/生物進料流中并不特別適合 去除可溶性雜質(zhì)如DNA和宿主細胞蛋白。這類污染物可以干擾隨后的下游純化步驟，包括A 蛋白親和捕獲和結(jié)合/洗脫離子交換色譜步驟。這些雜質(zhì)可以顯著降低產(chǎn)物結(jié)合能力并限 制色譜介質(zhì)的操作壽命。較高的雜質(zhì)裝載還可能需要引入額外的流過拋光步驟、昂貴的膜 吸附劑或裝有陰離子交換樹脂的柱以將雜質(zhì)裝載進一步降低至可接受的水平內(nèi)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 針對上述需要以及與深層過濾介質(zhì)相關(guān)的問題，本發(fā)明通過提供在濾器中具有減 少量的可提取物的深層過濾介質(zhì)來避免大量預(yù)沖洗需要以及有機、無機和生物負荷可提取 物的釋放，從而減少使用前沖洗需要的水量，并且在收獲的細胞培養(yǎng)流體的流過吸附過程 中表現(xiàn)出增加的對細胞培養(yǎng)物/生物進料流內(nèi)的宿主細胞蛋白和其他可溶性雜質(zhì)的結(jié)合能 力。
[0016] 本發(fā)明的另一目的是提供一種復(fù)合深層過濾介質(zhì)，其包含一體的無紡第一層與第 二層，所述第二層包含（1)纖維，（2)助濾劑，和(3)濕強樹脂，其具有減少量的有機、無機和 生物負荷可提取物，從而減少使用前沖洗所需要的水量。
[0017] 本發(fā)明的另一目的是提供一種深層過濾介質(zhì)，其包含（1)無紡布，其包括聚丙烯、 聚酯、聚乙烯、尼龍、聚丙烯腈、碳和玻璃，（2)原纖化纖維，其包括具有約10mL-800mL的加拿 大標準游離度的聚丙烯腈或聚丙烯腈共聚物纖維，（3)助濾劑，其包括二氧化硅、氧化鋁、玻 璃、金屬氧化物或混合金屬氧化物、離子交換樹脂和碳，以及(4)濕強樹脂(wet strength resin)，其包括水溶性合成聚合物，包含基于尿素或三聚氰胺-甲醛的聚合物，聚氨基聚酰 胺-表氯醇(PAE)聚合物和乙醛酸化(glyoxalated)的聚丙稀酰胺(GPAM)樹脂。
[0018] 本發(fā)明的另一目的是提供深層過濾介質(zhì)，其具有減少的顆粒脫落。
[0019] 本發(fā)明的另一目的是提供一種深層過濾介質(zhì)，其具有提高的化學(xué)或輻射抗性以及 比常規(guī)深層過濾介質(zhì)低的沖洗體積。
[0020] 本發(fā)明的另一目的是提供全合成過濾介質(zhì)，其具有高污垢容納能力以及優(yōu)秀的 粗\中和細顆粒保留。
[0021] 本發(fā)明的另一目的是提供一種深層過濾介質(zhì)，其具有增加的對生物產(chǎn)物進料流內(nèi) 的可溶性過程雜質(zhì)的結(jié)合能力。這些可溶性過程雜質(zhì)可以包括宿主細胞蛋白（HCP)和DNA。 這樣的深層過濾介質(zhì)允許從收獲的細胞培養(yǎng)流體(HCCF)進料流清除低水平的宿主細胞蛋 白和DNA雜質(zhì)。
[0022] 本發(fā)明的另一目的是提供一種深層過濾介質(zhì)，其通過利用對可溶性雜質(zhì)的流過吸 附方法來完成這一低水平的雜質(zhì)清除，所述可溶性雜質(zhì)與不溶性雜質(zhì)、細胞碎片和膠體物 質(zhì)的二次澄清一起出現(xiàn)。
[0023] 本發(fā)明的另一目的是提供一種深層過濾介質(zhì)，其并入具有足夠表面積和表面電荷 特征的無機助濾劑，以便通過離子和疏水吸附機制的組合結(jié)合進料流內(nèi)的給定群體的可溶 性過程雜質(zhì)，如HCP和DNA。
[0024]本發(fā)明的額外的特征和優(yōu)勢會在下文的詳細描述和權(quán)利要求書中示出。本領(lǐng)域技 術(shù)人員會清楚，可以進行本發(fā)明的許多修改和變化而不背離其精神和范圍。應(yīng)當理解上文 的一般描述和下文的詳細描述、權(quán)利要求書以及附圖僅為示例性和解釋性的，并且旨在提 供本教學(xué)的各種實施方案的解釋。本文所述的具體實施方案僅通過實例的方式提供，并不 意味著以任何方式限制。
【附圖說明】
[0025]圖1示出本發(fā)明的深層過濾介質(zhì)的一個實例的示意實施方案；
[0026]圖2示出用lOOL/m2水以600LMH沖洗的濾器的總有機碳(TOC)沖洗曲線；以指定間 隔收集部分用于TOC分析；
[0027]圖3示出用澄清的非表達的CHO細胞培養(yǎng)物以100LMH至lOOL/m2裝載的濾器的壓力 特征譜；
[0028]圖4示出用澄清的非表達的CHO細胞培養(yǎng)物（173NTU)以100LMH至lOOL/m2裝載的濾 器的濁度穿透曲線；以指定間隔收集部分；
[0029]圖5示出用澄清的非表達的CHO細胞培養(yǎng)物(91yg/mL)以100LMH至lOOL/m2裝載的 濾器的DNA穿透曲線；以指定間隔收集部分；
[0030] 圖6A是根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，實施例25中描述的偶聯(lián)的初步和二次澄清裝 置的壓力特征譜(初步:二次澄清深層濾器的面積比例為2:1);
[0031] 圖6B是根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，偶聯(lián)的Millistak+初步和二次深層過濾基準 (D0HC/X0HC，黑線）以及偶聯(lián)的原型初步和二次深層濾器(裝置ID 7-1/裝置ID 7-2,灰線） 的HCP雜質(zhì)穿透的圖；
[0032] 圖7A是根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，實施例25中描述的未偶聯(lián)的二次澄清裝置的 壓力特征譜；以及
[0033] 圖7B是根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，未偶聯(lián)的二次深層濾器（ID 7_3，HCP:黑線， DNA:黑色圓圈）和未偶聯(lián)的二次深層濾器（ID 7-2，HCP:灰線，DNA:灰色圓圈）的HCP和DNA雜 質(zhì)穿透的圖。
【具體實施方式】
[0034] 為了本說明書和所附權(quán)利要求書的目的，除非另有說明，無論是否明確指出，說明 書和權(quán)利要求書中使用的表示成分的數(shù)量、物質(zhì)的百分比或比例、反應(yīng)條件的所有數(shù)字以 及其他數(shù)值應(yīng)理解為在所有情況下受到術(shù)語"約"修飾。術(shù)語"約"一般指認為等同于所列舉 的值(即，具有相同功能或結(jié)果）的一定范圍的數(shù)字。在很多情況下，術(shù)語"約"可以包括最近 的有效數(shù)字左右的數(shù)目。
[0035] 因此，除非有相反的指示，以下說明書和所附權(quán)利要求書中所示的數(shù)值參數(shù)為近 似值，其可以根據(jù)本發(fā)明追求獲得的期望特性而變化。至少，并且不試圖限制權(quán)利要求書的 范圍的等同物的原則的應(yīng)用，每個數(shù)值參數(shù)應(yīng)當至少根據(jù)報道的有效數(shù)字的數(shù)目并通過應(yīng) 用普通的舍入技術(shù)來理解。此外，本文公開的所有范圍應(yīng)理解為涵蓋其中包括的所有亞范 圍。
[0036] 在進一步詳細描述本發(fā)明之前會定義多個術(shù)語。使用這些術(shù)語并不限制本發(fā)明的 范圍，而僅用來方便本發(fā)明的描述。
[0037] 無論上文或下文引用的所有出版物、專利和專利申請整體援引加入本文，與具體 并單獨地表明每個單獨的出版物、專利或?qū)＠暾堅尤氡疚南嗤?br>[0038] 如本文所用，單數(shù)形式"一個(a)"、"一個(an)"和"這個"包括復(fù)數(shù)指代，除非上下 文另有明確指定。
[0039]術(shù)語"泡點孔徑"或"BP"是過濾介質(zhì)中最大的孔的孔徑。
[0040] 如本文所用，短語"細胞培養(yǎng)物"包括細胞、細胞碎片和膠體顆粒、所關(guān)注的生物分 子、HCP以及DNA。
[0041] 如本文所用，術(shù)語"捕獲步驟" 一般指用于用色譜樹脂結(jié)合靶分子的方法，其導(dǎo)致 包含靶分子和樹脂的沉淀物的固相。通常，隨后利用洗脫步驟回收靶分子，所述洗脫步驟從 固相去除靶分子，從而導(dǎo)致分離靶分子與一種或多種雜質(zhì)。在各種實施方案中，捕獲步驟可 以利用色譜介質(zhì)如樹脂、膜或整體柱進行。
[0042]在本文中可交換使用時，術(shù)語"中國倉鼠卵巢細胞蛋白"和"CHOP"指源自中國倉鼠 卵巢（"CH0"）細胞培養(yǎng)物的宿主細胞蛋白（"HCP"）的混合物。HCP或CHOP-般作為雜質(zhì)存在 于細胞培養(yǎng)基或裂解物中（例如，收獲的包含所關(guān)注的蛋白或多肽(例如，CHO細胞中表達的 抗體或免疫粘附素）的細胞培養(yǎng)液）。一般來說，包含所關(guān)注的蛋白的混合物中存在的CHOP 的量提供所關(guān)注的蛋白的純度的量度。通常，蛋白混合物中CHOP的量以相對于混合物中所 關(guān)注的蛋白的量的百萬分比表示。
[0043] 如本文所用，術(shù)語"澄清步驟"或簡單的"澄清"一般指在純化生物分子中最初使用 的一個或多個步驟。澄清步驟一般包括利用一個或多個步驟去除細胞和/或細胞碎片，所述 一個或多個步驟包括任何以下單獨步驟或它們的各種組合，例如離心和深層過濾、切向流 過濾、微濾、沉淀、絮凝和沉降。在一些實施方案中，本發(fā)明提供對各種純化方案中常用的常 規(guī)澄清步驟的改進。澄清步驟一般包括去除一種或多種不期望的實體，并且通常在包括捕 獲期望的靶分子的步驟之前進行。澄清的另一方面是去除樣品中的可溶性和不溶性組分， 所述組分后來可以導(dǎo)致純化