過(guò)程中無(wú)菌濾器的污染，從而使得總純化過(guò)程更經(jīng)濟(jì)。澄清步 驟常包括上游的初步澄清步驟與下游的二次澄清。來(lái)自現(xiàn)代生產(chǎn)分批生物反應(yīng)器的大收獲 體積(<25,000L)和高細(xì)胞密度的細(xì)胞培養(yǎng)收獲物和高固體原料的澄清通常在任何隨后的 色譜操作等之前需要初步以及二次澄清步驟。
[0044] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"粗濾"或"粗/中濾" 一般指在生物分子的純化中去除大部分全 細(xì)胞和一些細(xì)胞碎片。
[0045] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"細(xì)濾" 一般指在生物分子的純化中去除大部分細(xì)胞碎片、膠體 顆粒和可溶性雜質(zhì)如HCP、DNA、內(nèi)毒素、病毒和脂質(zhì)。
[0046] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"柱體積"或"CV"指等于過(guò)濾介質(zhì)體積的液體體積。過(guò)濾介質(zhì)的 體積可以通過(guò)產(chǎn)物的表面積和濾器的厚度進(jìn)行計(jì)算。
[0047] 濾器通量值一般以"升/平方米"或"L/m2"表示，但是為了相等比較，"柱體積"或 "CV"用來(lái)說(shuō)明樣品之間厚度的大差異。
[0048] 術(shù)語(yǔ)"污染物"、"雜質(zhì)"和"碎片"在本文中可交換使用，指任何外源或不期望物質(zhì)， 包括生物大分子如DNA、RNA、一種或多種宿主蛋白（HCP或CHOP)、內(nèi)毒素、病毒、脂質(zhì)以及一 種或多種添加劑，其可以存在于包含所關(guān)注的蛋白或多肽(例如，抗體)的樣品中，利用本發(fā) 明的深層濾器將其與一種或多種外源或不期望分子分離。
[0049]應(yīng)當(dāng)理解當(dāng)宿主細(xì)胞為另一哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型、大腸桿菌、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)或植物 時(shí)，HCP指在宿主細(xì)胞的裂解物中發(fā)現(xiàn)的除靶蛋白之外的蛋白。
[0050]如本文所用，術(shù)語(yǔ)"平均流孔徑"或"MFP"是一定壓降下的孔直徑，在該壓降下通過(guò) 濕潤(rùn)過(guò)濾介質(zhì)的流量是通過(guò)干燥過(guò)濾介質(zhì)的流量的50%。
[0051 ]如本文所用，術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"或"mAb"指獲得自一群基本上均質(zhì)的抗體的抗體， 即該群包含的各個(gè)抗體除了少量可能天然存在的突變之外是相同的。
[0052]如本文所用，術(shù)語(yǔ)"有機(jī)可提取物"指污染物，在沖洗期間使用的水或其他含水溶 液的存在下，其可能迀移自或提取自用來(lái)制備過(guò)濾介質(zhì)或膜如多孔深層過(guò)濾介質(zhì)的材料。 這些污染物還可以包括在沖洗期間可能脫落自濾器的構(gòu)建體本身的材料。
[0053]如本文所用，短語(yǔ)"低或較低有機(jī)可提取物介質(zhì)"指一種介質(zhì)，當(dāng)提取或用水沖洗 時(shí)，其導(dǎo)致去除可提取物，所述可提取物在擴(kuò)大(exaggerated)的時(shí)間和溫度條件下可以從 材料迀移入包括水在內(nèi)的溶劑。
[0054] 術(shù)語(yǔ)"總有機(jī)可提取物"或"TOf指存在于含水溶液如水中并測(cè)量為碳含量的有機(jī) 分子的量度。用來(lái)測(cè)量TOC的分析技術(shù)通常包括將溶液中的所有有機(jī)分子氧化為二氧化碳， 測(cè)量所得的CO 2濃度，以及將這個(gè)反應(yīng)關(guān)聯(lián)至已知的碳濃度。
[0055] 術(shù)語(yǔ)"百萬(wàn)分?jǐn)?shù)"或"ppm"在本文中可交換使用。
[0056] 孔徑評(píng)級(jí)通常做為標(biāo)稱(chēng)值給出。在某些情況下，制造商提供平均流孔(MFP)徑或泡 點(diǎn)(BP)孔徑。MFP和BP均可以利用毛細(xì)管流動(dòng)孔徑分析儀進(jìn)行測(cè)量。
[0057] 術(shù)語(yǔ)"靶分子"、"靶生物分子"、"期望的靶分子"和"期望的靶生物分子"在本文中 可交換使用，一般指所關(guān)注的多肽或產(chǎn)物，期望從一種或多種不期望的實(shí)體純化或分離，例 如可以存在于包含所關(guān)注的多肽或產(chǎn)物的樣品中的一種或多種雜質(zhì)。
[0058] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"通量"表示濾過(guò)濾器的體積。
[0059] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"污垢容納能力"等于來(lái)自直接收獲或以前澄清的給定細(xì)胞培養(yǎng) 流體的過(guò)濾通量。較高的通量代表較高的污垢容納能力。
[0060] 本發(fā)明的深層濾器包含組分(A)纖維，（B)助濾劑，（C)濕強(qiáng)樹(shù)脂和(D)無(wú)紡布。各種 構(gòu)型的這些組分的組合獲得深層濾器，其具有低可提取物，高污垢容納能力，良好的化學(xué) 和/或輻射抗性，以及增加的對(duì)包含生物產(chǎn)物的進(jìn)料流中所含的宿主細(xì)胞蛋白和其他可溶 性雜質(zhì)的結(jié)合能力。
[0061] 過(guò)濾材料
[0062] 組分A.用于深層濾器的纖維材料已廣泛公開(kāi)。基于非纖維素的材料包括微玻璃纖 維以及各種合成聚合物如聚丙烯和聚酯。特別有用的是原纖化纖維，這是已加工以產(chǎn)生更 多表面積和分支結(jié)構(gòu)的纖維。合適的原纖化纖維包括聚丙烯腈或者含有聚丙烯腈的共聚 物、聚乙稀、聚丙稀以及Kuraray Co. ,Ltd.的Vectran，一種基于芳香聚酯的纖維，單獨(dú)或組 合使用。
[0063]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用制備自聚丙烯腈（PAN)共聚物的纖維（Sterling Fibers Inc·,Pace，F(xiàn)L,USA)〇
[0064] 纖維的原纖化程度影響纖維的稀釋?xiě)腋∫旱募幽么髽?biāo)準(zhǔn)游離度(CSF)或排水速 度。例如，較高原纖化的纖維傾向于具有較低的CSF。優(yōu)選的CSF范圍為10mL-800mL;在一些 實(shí)施方案中，使用600mL-750mL的范圍。在其他實(shí)施方案中，優(yōu)選200mL-600mL的范圍。在其 他實(shí)施方案中，優(yōu)選50mL-300mL的范圍。在其他實(shí)施方案中，可以將具有不同CSF的原纖化 纖維組合以產(chǎn)生10mL-800mL范圍中的平均CSF。
[0065] 組分B.助濾劑可以是以各種形狀、大小和材料提供的顆粒。例如，助濾劑顆粒可以 為球形、纖維狀、板狀或不規(guī)則的。此外，可以將顆粒以本領(lǐng)域已知的其他方式研磨、磨碎、 混合或加工以產(chǎn)生不規(guī)則形狀的較小顆粒。如同顆粒的形狀，助濾劑的大小不必是單一值。 在濾器中具有粒徑分布是可取的。
[0066] 可以進(jìn)行加工如篩分或分類(lèi)以將顆粒按大小分為較窄粒徑分布的部分。一般來(lái) 說(shuō)，助濾劑顆粒的大小的范圍可以為約〇 . 〇Iwn-約5mm，在一些實(shí)施方案中優(yōu)選約1 Ομπι-約 500μπ?，在其他實(shí)施方案中約40μL?-約200μπ?，在其他實(shí)施方案中約Ο.ΙμL?-約50μL?，以及在其 他實(shí)施方案中約〇. Olym-約50μπι。
[0067] 助濾劑可以是多孔的，具有互相連通的空隙或封閉室孔隙，或者是無(wú)孔的。特別是 在封閉室空隙材料的情況下，如果將顆粒通過(guò)研磨、混合等加工以產(chǎn)生較小顆粒，可以將封 閉的孔打開(kāi)以顯示孔隙，并且顆粒會(huì)基本上變?yōu)闊o(wú)孔的。
[0068] 可以使用的合成助濾劑的實(shí)例包括二氧化硅、氧化鋁、玻璃、其他金屬氧化物或混 合金屬氧化物、離子交換樹(shù)脂和碳。還可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將這些材料表 面改性以賦予電荷、疏水性或其他功能性。
[0069] 具有足夠表面積和表面電荷特征的無(wú)機(jī)助濾劑通過(guò)離子和疏水吸附機(jī)制的組合 結(jié)合進(jìn)料流內(nèi)的特定群體的可溶性過(guò)程雜質(zhì)，如HCP和DNA。
[0070] 合適的二氧化硅助濾劑的實(shí)例包括但不限于沉淀二氧化硅、硅膠和氣相二氧化 硅。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選的二氧化硅助濾劑優(yōu)選選自沉淀二氧化硅如Sipernat(K) (Evonik Industries AG,Hanau-Wolfgang,Germany)或石圭膠如Kieselgel 60(Merck KGaA, Darmstadt,Germany)〇
[0071] 氧化鋁有多種形式：多孔的、無(wú)孔的、酸性pH、中性pH、堿性(堿)pH等。在某些實(shí)施 方案中，優(yōu)選的氧化鋁助濾劑實(shí)施方案是多孔的，并且具有堿性pH，如Merck KGaA, Darmstadt Germany氧化錯(cuò) 150喊性。
[0072] 玻璃助濾劑實(shí)例包括可控多孔玻璃、e-玻璃和泡沫玻璃(expanded glass)。優(yōu)選 的玻璃助濾劑實(shí)施方案為泡沫玻璃，更優(yōu)選地，由回收玻璃制成的泡沫玻璃，如Poraver?, (Poraver North America Inc.,Ontario,Canada)〇
[0073] 合適的離子交換樹(shù)脂是多孔和剛性的，并且優(yōu)選在水的存在或不存在下不會(huì)顯著 膨脹或收縮。優(yōu)選的離子交換樹(shù)脂實(shí)施方案優(yōu)選是帶正電荷的。
[0074] 碳的實(shí)例包括活性炭球或者源自人造絲或其他合成來(lái)源的纖維。
[0075]助濾劑可以單獨(dú)或組合使用，只要它們產(chǎn)生上述粒徑范圍。相對(duì)于纖維和助濾劑 的總重量的重量含量的范圍可以為〇%-約90%，在一些實(shí)施方案中，約40%-約80%。
[0076]組分C.濕強(qiáng)樹(shù)脂是本領(lǐng)域已知的。它們是水溶性合成聚合物，具有陰離子和/或陽(yáng) 離子基團(tuán)，用來(lái)在濕潤(rùn)時(shí)賦予材料強(qiáng)度。合適的濕強(qiáng)樹(shù)脂為基于尿素或三聚氰胺-甲醛的聚 合物、聚氨基聚酰胺-表氯醇(PAE)聚合物和乙醛酸化的聚丙烯酰胺(GPAM)。商業(yè)樹(shù)脂可容 易地獲得自 Ashland，Inc · (formerly Hercules Inc.) ,The Dow Chemical Company,BASF Corporation和Georgia-Pacific Chemicals LLC。基于纖維和助濾劑的總重量的濕強(qiáng)樹(shù)脂 的重量含量范圍為約0.5%-5%，優(yōu)選1 %-3%。
[0077]組分D.無(wú)紡布可廣泛獲得，有不同材料、纖維直徑、基本重量、厚度和孔徑評(píng)級(jí)。它 們可以通過(guò)各種技術(shù)制備，如熔噴、氣流成網(wǎng)(airlaid)、紡粘法、水刺、熱粘合、靜電紡絲和 濕法。無(wú)紡布可以制備自聚合物、無(wú)機(jī)物、金屬或天然纖維。合適的材料包括聚丙烯、聚酯、 聚乙烯、尼龍、聚丙烯腈、碳和玻璃。根據(jù)期望的特性，纖維直徑的范圍可以為約Inm-約1_。 在一優(yōu)選實(shí)施方案中，纖維直徑范圍為約IOnm-約30μηι。基本重量定義為每給定面積的材料 重量。一般來(lái)說(shuō)，基本重量范圍為5_350g/m 2。
[0078]在一優(yōu)選實(shí)施方案中，基本重量范圍為20_300g/m2。無(wú)紡布的厚度可以為50μπι-約 lcm。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，無(wú)紡布的厚度為約0· 1-0.3cm。
[0079] 在另一實(shí)施方案中，無(wú)紡布的厚度為約100μπι-約500μπι。
[0080] 在其他實(shí)施方案中，可以將幾層無(wú)紡布疊在一起以獲得200μπι-1，000μπι的厚度。
[0081] 將過(guò)濾組分(A)至(D)以各種構(gòu)型組合以制備具有梯度密度孔結(jié)構(gòu)的深層濾器。
[0082] 在一優(yōu)選實(shí)施方案中，將過(guò)濾介質(zhì)排列，從而每層的孔徑評(píng)級(jí)逐漸減少（即，孔徑 評(píng)級(jí)從過(guò)濾介質(zhì)的頂部（即，介質(zhì)的上游側(cè))至底部（即，介質(zhì)的下游側(cè))變?。渲羞M(jìn)料流 方向通常也是從過(guò)濾介質(zhì)的頂部至底部。
[0083] 為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的目的提供以下實(shí)施例，而不應(yīng)當(dāng)視為限制。此外，提供以 下實(shí)施例以向本領(lǐng)域技術(shù)人員提供怎樣進(jìn)行和怎樣實(shí)施本發(fā)明的方法的完整公開(kāi)和描述， 并且不是為了限制本發(fā)明的范圍。已努力確保所用數(shù)字(例如量、溫度等)的準(zhǔn)確性，但是應(yīng) 當(dāng)考慮一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另有說(shuō)明，溫度以攝氏度(°C)計(jì)，化學(xué)反應(yīng)在大氣壓或跨 膜壓下進(jìn)行，如本文所示，術(shù)語(yǔ)"環(huán)境溫度"指約25°C，而"環(huán)境壓力"指大氣壓。
[0084] 除非在本文中另外特別提供，下文（I)至（IV)節(jié)中提供的以下方法、材料、過(guò)程和 條件用于本發(fā)明的各種實(shí)施方案的實(shí)施，并且是為了本發(fā)明的示例：
[0085] I.層構(gòu)型
[0086] 在以下實(shí)例中，并且如圖1所示，這些實(shí)施方案中的每個(gè)濾器包含多達(dá)三(3)個(gè)組 分層:其中零(〇)層為無(wú)紡布或堆疊的多片無(wú)紡布以給出期望的厚度，而一（1)層和二(2)層 可以相同，但是可以任選地由相似或不同組成的相似或不同材料制成。
[0087] II .Handsheet形成
[0088] -般來(lái)說(shuō)，如果使用，將纖維、水和濕強(qiáng)樹(shù)脂在可容易獲得的攪拌器（Blendtec Corporat ion，Orem，UT，USA)中進(jìn)行加工然后混合助濾劑。通過(guò)重力排水將衆(zhòng)過(guò)濾在網(wǎng)狀支 持物上。通過(guò)真空過(guò)濾并在I 〇5°C下干燥I _2h來(lái)去除剩余的水。
[0089] III.加工規(guī)模過(guò)濾介質(zhì)的形成
[0090] 使纖維和助濾劑形成加工規(guī)模的深層過(guò)濾介質(zhì)的許多方法是本領(lǐng)域已知的：氣流 成網(wǎng)（8；[1-137；[1^)、恪壓(111611：1代88；[1^)、機(jī)械壓縮和濕法成網(wǎng)。制備1層和2層的深層過(guò) 濾介質(zhì)的優(yōu)選方法為濕法成網(wǎng)方法:將所有組分分散在水中以形成均勻混合的漿。將漿施 用