器IB僅需要 50L/m2水沖洗以達(dá)到~I. Ippm的相似TOC值。
[0178] 實(shí)施例10
[0179] 使實(shí)施例1中的濾器IB進(jìn)行堿消毒并用非表達(dá)的CHO進(jìn)料濃縮液(centrate)測(cè)試 通量和保留。
[0181] 濾器IB證實(shí)有或無(wú)使用前堿消毒處理步驟，具有相似的通量和保留值。
[0182] 實(shí)施例11
[0183] 使實(shí)施例1中的濾器IC中的1層進(jìn)行γ輻射(25_40kGy)。對(duì)照射和未照射的樣品進(jìn) 行可提取物沖洗。暴露于γ之后可提取物略微增加。
[0185] 實(shí)施例12
[0186] 還用A蛋白捕獲步驟純化的單克隆抗體進(jìn)料測(cè)試實(shí)施例1中的濾器IC的通量和保 留。裝載為l〇〇L/m2。還確定匯集的濾液中的宿主細(xì)胞蛋白和DNA去除以及產(chǎn)物回收率。還測(cè) 試常規(guī)深層濾器MW i stak+? XOHC用于比較。
[0188] 濾器IC證實(shí)與常規(guī)XOHC相比較好的HCP去除和較高的產(chǎn)物回收率，同時(shí)保持相似 的濁度保留和DNA保留值。
[0189] 實(shí)施例13
[0190] 濾器ΡΑΝ/DE和PAN/氧化鋁
[0191] 使實(shí)施例1中的濾器ID和IE進(jìn)行堿消毒然后通量和保留測(cè)試。還測(cè)試常規(guī)深層濾 器Mil丨i stak+? XOHC用于比較。
[0193] 實(shí)施例14
[0194] 使實(shí)施例3中的濾器3A進(jìn)行可提取物沖洗。還測(cè)試常規(guī)深層濾器Millistak+DOHC 用于比較。
[0196] 濾器3A證實(shí)比常規(guī)DOHC低的TOC可提取物。
[0197] 實(shí)施例15
[0198] 使實(shí)施例4中的濾器4A的0層進(jìn)行γ輻射(25_40kGy)。對(duì)照射和未照射的樣品進(jìn)行 可提取物沖洗。暴露于γ之后可提取物沒(méi)有明顯變化。
[0200] 實(shí)施例16
[0201]用mAb進(jìn)料使實(shí)施例4中的濾器4Α進(jìn)行通量和保留測(cè)試。
[0203]濾器4A證實(shí)與常規(guī)DOHC相比較高的通量和濁度保留。
[0204] 實(shí)施例17
[0205]使實(shí)施例1中的濾器IC進(jìn)行可提取物沖洗。
[0206 ]用以前用Mi 11 istak+? DOHC初步澄清的mAb進(jìn)料使實(shí)施例5中的濾器5A和實(shí)施例1 中的濾器IC各自進(jìn)行通量和保留測(cè)試。還表征濾液的DNA保留。為了比較目的，還測(cè)試常規(guī) 纖維素/娃藻土介質(zhì)Millistak+? X0HC。結(jié)果在圖2-5中總結(jié)并示出。
[0208]圖2-5中示出的測(cè)試結(jié)果證實(shí)：
[0209] 1.濾器IC (PAN/1EX珠)不僅具有比常規(guī)濾器XOHC低的總TOC，而且可提取物特征譜 開(kāi)始較低且結(jié)束較低。
[0210] 2.濾器1C(PAN/IEX珠)和5A(無(wú)紡布/PAN/IEX珠)具有比XOHC低的壓力特征譜。事 實(shí)上，XOHC濾器達(dá)到20psi，而本發(fā)明的濾器遠(yuǎn)低于lOpsi。這導(dǎo)致可以通過(guò)本發(fā)明的濾器加 工的進(jìn)料的通量顯著較高。
[0211] 3.濾器1C(PAN/IEX珠）和5A(無(wú)紡布/PAN/IEX珠）具有比XOHC低的濁度特征譜?？?以認(rèn)為本發(fā)明的濾器具有較高的濁度保留。與XOHC中在~40L/m2的一些小突破相比，在濾 器IC和5A中，高達(dá)100L/m2仍未出現(xiàn)顯著濁度突破。濾器的繼續(xù)裝載仍可以提供良好保留。 [0 212] 4.濾器1C(PAN/IEX珠)和5A(無(wú)紡布/PAN/IEX珠)具有比XOHC低的DNA特征譜?？梢?認(rèn)為本發(fā)明的濾器具有較高的DNA保留。與XOHC中在~50L/m 2的一些小突破相比，在濾器IC 和5A中，高達(dá)100L/m2仍未出現(xiàn)顯著DNA突破。濾器的繼續(xù)裝載仍可以提供良好保留。
[0213] 實(shí)施例18
[0214] 為了進(jìn)一步說(shuō)明PAN與纖維素相比的優(yōu)勢(shì)，利用水漿中的1%纖維形成全纖維墊。 將墊在105°C下干燥2h。隨后，將每個(gè)墊在攪拌下浸入水中幾小時(shí)。纖維素重新分散為松散 纖維，而PAN保持為墊，沒(méi)有可觀察到的松散纖維。
[0215] 在以下實(shí)施例19-27中，在組分B-助濾劑下，硅膠粒徑范圍是可商購(gòu)的硅膠60的分 數(shù)，硅膠60由Merck KGaA(Darmstadt，661'11^115〇生產(chǎn)，具有約6(^(611111)的孔徑。在這些實(shí)施 例中的本發(fā)明的某些實(shí)施方案中使用的二氧化硅顆粒通過(guò)篩分操作分離，其中標(biāo)記"細(xì)二 氧化硅顆粒"的第一篩分部分導(dǎo)致具有 <(小于或等于）約5微米粒徑的小/細(xì)二氧化硅顆 粒，而標(biāo)記"粗二氧化硅顆粒"的第二篩分部分導(dǎo)致具有 <(小于或等于)約40μπι粒徑的大/ 粗二氧化娃顆粒。
[0216]表1.用于以下實(shí)施例的深層過(guò)濾介質(zhì)制品表


[0220] 實(shí)施例19
[0221] 用于靜態(tài)結(jié)合能力測(cè)量的一般方法。
[0222]將6克深層過(guò)濾介質(zhì)懸浮于300mL水中并混合以形成稀纖維漿。將懸浮液轉(zhuǎn)移至 500mLNalgene?瓶，利用額外的200mL水用于漂洗。將I OmL等份的纖維懸浮液轉(zhuǎn)移至預(yù)先 稱重的15mL離心管中。將離心管在臺(tái)式離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)5分鐘以沉淀纖維固體。通過(guò)移液器去 除上清，并且添加 IOmL的25mM Tris pH 7.3中的lg/L BSA或lg/L肌紅蛋白溶液?；蛘撸瑢?duì)于 宿主細(xì)胞蛋白靜態(tài)結(jié)合能力測(cè)量，使用已離心并通過(guò)〇.2μπι Millipore Express?.膜(EMD Millipore，Billerica，MA)無(wú)菌過(guò)濾的IOmL等份的收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液。然后將纖維懸浮液 在室溫下攪拌18小時(shí)。然后將離心管在臺(tái)式離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)5分鐘以沉淀纖維固體。對(duì)于蛋白 靜態(tài)結(jié)合能力測(cè)量，采集上清溶液的樣品用于在280nm(對(duì)于BSA)或409nm(對(duì)于肌紅蛋白） 處的UV-vis測(cè)量，并且確定與進(jìn)料樣品相比的蛋白濃度變化。
[0223]或者，對(duì)于宿主細(xì)胞蛋白靜態(tài)結(jié)合能力測(cè)量，采集ImL等份的上清溶液用于HCP ELISA測(cè)定。然后從離心管去除剩余的上清溶液，并且將潮濕的材料在烤箱中于60°C下干燥 18-36小時(shí)。確定干燥深層過(guò)濾介質(zhì)的最終重量，并且將這個(gè)值用來(lái)計(jì)算深層過(guò)濾介質(zhì)的靜 態(tài)結(jié)合能力，通過(guò)吸附的蛋白（或HCP)的量除以深層過(guò)濾介質(zhì)的重量來(lái)進(jìn)行計(jì)算。獲得的值 是以mg(蛋白）/g(深層過(guò)濾介質(zhì))表示的靜態(tài)結(jié)合能力。
[0224] 實(shí)施例20
[0225]所選深層過(guò)濾介質(zhì)制品的靜態(tài)結(jié)合能力測(cè)量
[0226]對(duì)根據(jù)實(shí)施例19中所述方法的各種深層過(guò)濾介質(zhì)進(jìn)行BSA和肌紅蛋白靜態(tài)結(jié)合能 力測(cè)量。
[0227]這些樣品的靜態(tài)結(jié)合能力在表2中提供。
[0228] 表2中的數(shù)據(jù)顯示對(duì)于所有深層過(guò)濾介質(zhì)制品，BSA靜態(tài)結(jié)合能力是相當(dāng)?shù)模瑹o(wú)論 PAN纖維類型、二氧化硅裝載或樹(shù)脂類型。相比之下，粗二氧化硅顆粒(具有小于或等于約40 M的粒徑)助濾劑對(duì)肌紅蛋白靜態(tài)結(jié)合能力具有出乎意料的強(qiáng)烈影響。缺少粗二氧化硅顆 粒助濾劑的4種深層過(guò)濾介質(zhì)制品未給出肌紅蛋白SBC(組合物1 -4、1 -6、1 -8、I -10 )，而其他 6種制品證實(shí)約30mg/g的高肌紅蛋白SBC(組合物I-1至1 -3、1 -5、1 -7和1 -9)。
[0229] 在7.3的應(yīng)用pH下，肌紅蛋白大部分是不帶電荷的（等電點(diǎn)=6.8-7.2)，而B(niǎo)SA是帶 負(fù)電荷的（等電點(diǎn)* 5)。在這類條件下，深層過(guò)濾介質(zhì)制品的適度BSA靜態(tài)結(jié)合能力可以通 過(guò)帶正電荷的粘合劑樹(shù)脂組分和帶負(fù)電荷的BSA之間的靜電相互作用而發(fā)生。在這些相同 條件下，在粗二氧化硅顆粒和不帶電荷的肌紅蛋白之間可以發(fā)生強(qiáng)疏水相互作用。雖然不 希望被任何理論束縛，但是認(rèn)為增加的肌紅蛋白靜態(tài)結(jié)合能力可以歸因于這些深層過(guò)濾介 質(zhì)制品實(shí)施方案中使用的粗二氧化硅顆粒助濾劑的相對(duì)大的表面積。
[0230] 表2.所選的深層過(guò)濾介質(zhì)制品的BSA和肌紅蛋白SBC。
[0232] 實(shí)施例21
[0233]所選深層過(guò)濾介質(zhì)制品的靜態(tài)結(jié)合能力測(cè)量
[0234]對(duì)根據(jù)上文實(shí)施例19中所述方法的各種深層過(guò)濾介質(zhì)制品進(jìn)行BSA、肌紅蛋白和 HCP靜態(tài)結(jié)合能力測(cè)量。這些樣品的靜態(tài)結(jié)合能力在表3中提供。
[0235]表3中的數(shù)據(jù)顯示，對(duì)于所有深層過(guò)濾介質(zhì)制品，BSA靜態(tài)結(jié)合能力是相當(dāng)?shù)摹４?外，如表3中看到的，二氧化硅助濾劑的類型對(duì)肌紅蛋白和HCP靜態(tài)結(jié)合能力具有強(qiáng)烈影響。 利用Sipernat 120助濾劑制備的兩種深層過(guò)濾介質(zhì)制品給出較低的肌紅蛋白和HCP靜態(tài)結(jié) 合能力值，對(duì)于肌紅蛋白和HCP，分別為約18mg/g和3mg/g。
[0236] 其中利用粗二氧化硅顆粒制備兩種制品的本發(fā)明的實(shí)施方案導(dǎo)致增加的肌紅蛋 白和HCP靜態(tài)結(jié)合能力值，分別為49mg/g和6mg/g。這些結(jié)果是令人驚訝的，因?yàn)樽畛醪⑽搭A(yù) 期所用的特定類型的二氧化硅助濾劑會(huì)在這個(gè)特定應(yīng)用內(nèi)提供明顯不同的吸附特性或結(jié) 合能力。這些結(jié)果表明深層過(guò)濾介質(zhì)制品中采用的二氧化硅助濾劑的類型強(qiáng)烈影響過(guò)濾介 質(zhì)在蛋白和雜質(zhì)結(jié)合能力方面的性能以及在目標(biāo)應(yīng)用中的吸附介質(zhì)性能特征。
[0237] 表3.所選的深層過(guò)濾介質(zhì)制品的BSA、肌紅蛋白和HCP SBC。
[0239] 實(shí)施例22
[0240] 所選深層過(guò)濾介質(zhì)制品的靜態(tài)結(jié)合能力測(cè)量
[0241] 對(duì)根據(jù)上文實(shí)施例19中所述方法的各種深層過(guò)濾介質(zhì)制品進(jìn)行BSA、肌紅蛋白和 HCP靜態(tài)結(jié)合能力測(cè)量。這些樣品的靜態(tài)結(jié)合能力在表4中提供。
[0242] 表4中的數(shù)據(jù)顯示BSA、肌紅蛋白和HCP靜態(tài)結(jié)合能力值并未受到總二氧化硅助濾 劑裝載或兩種二氧化硅粒徑(粗二氧化硅顆粒和細(xì)二氧化硅顆粒）的混合比例的大變化的 顯著影響。在深層過(guò)濾介質(zhì)制品3-1至3-4中消除濕強(qiáng)粘合劑樹(shù)脂僅導(dǎo)致這4種制品的BSA靜 態(tài)結(jié)合能力的少量減少。
[0243] 表4.所選的深層過(guò)濾介質(zhì)制品的BSA、肌紅蛋白和HCP SBC。
[0245] 實(shí)施例23
[0246] 所選深層過(guò)濾介質(zhì)制品的靜態(tài)結(jié)合能力測(cè)量
[0247] 對(duì)根據(jù)上文實(shí)施例19中所述方法的各種深層過(guò)濾介質(zhì)制品進(jìn)行BSA、肌紅蛋白和 HCP靜態(tài)結(jié)合能力測(cè)量。這些樣品的靜態(tài)結(jié)合能力在表5中提供。
[0248]表5中的數(shù)據(jù)顯示所有評(píng)價(jià)的比較深層過(guò)濾介質(zhì)制品的低肌紅蛋白靜態(tài)結(jié)合能力 值。利用纖維素衆(zhòng)、娃藻土(DE)助濾劑和相同的Wet strenght resinC⑩濕強(qiáng)粘合劑樹(shù)脂 構(gòu)建這些比較深層過(guò)濾介質(zhì)制品。這些樣品提供進(jìn)一步的證據(jù)，證明與深層過(guò)濾介質(zhì)制品 中通常采用的DE助濾劑相比，粗二氧化硅顆粒助濾劑的出乎意料的吸附特性。
[0249] 還發(fā)現(xiàn)在實(shí)施例4-5至4-9中并入Wet strenght resinCl·?濕強(qiáng)粘合劑樹(shù)脂導(dǎo)致 BSA靜態(tài)結(jié)合能力的顯著增加。這個(gè)結(jié)果與帶負(fù)電荷的BSA和7.3的應(yīng)用pH下的陽(yáng)離子濕強(qiáng) 粘合劑樹(shù)脂之間的吸附靜電相互作用是一致的。通過(guò)HCP ELISA測(cè)定評(píng)價(jià)的4種深層過(guò)濾介 質(zhì)制品的HCP靜態(tài)結(jié)合能力是低的。
[0250] 表5.所選的深層過(guò)濾介質(zhì)制品的BSA、肌紅蛋白和HCP SBC。
[0252] 實(shí)施例24
[0253] 所選深層過(guò)濾介質(zhì)制品的靜態(tài)結(jié)合能力測(cè)量
[0254] 對(duì)根據(jù)上文實(shí)施例19中所述方法的各種深層過(guò)濾介質(zhì)制品進(jìn)行BSA、肌紅蛋白和 HCP靜態(tài)結(jié)合能力測(cè)量。這些樣品的靜態(tài)結(jié)合能力在表6中提供。
[0255] 表6中的數(shù)據(jù)顯示深層過(guò)濾介質(zhì)制品6-2至6-4的比較例的低BSA、肌紅蛋白和HCP 靜態(tài)結(jié)合能力值。利用僅PAN、僅纖維素或者纖維素和DE助濾劑的混合物制備這些深層過(guò)濾 介質(zhì)制品。相比之下，將大二氧化硅顆粒助濾劑并入6-1深層過(guò)濾介質(zhì)制品提供適度的BSA SBC以及高肌紅蛋白和HCP靜態(tài)結(jié)合能力值。這些實(shí)例提供進(jìn)一步的證據(jù)，證明與這類深層 過(guò)濾介質(zhì)制品中通常采用的DE助濾劑和構(gòu)建的其他材料相比，EMD二氧化硅助濾劑的特別 吸附特性。
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