HEp-2 反應(yīng)性，如同使用 Quanta Lite ANA ELISA套組（IN0VA Diagnostics)的ELISA測定所示；其中陰性對照組為一不含細(xì)胞核與 細(xì)胞質(zhì)抗原的抗體的人類血清；以及強(qiáng)與弱陽性對照組為已知分別具有豐富與小量細(xì)胞核 與細(xì)胞質(zhì)抗原的抗體的人類血清。
[0043] 圖14B顯示LM52及ibalizumab對于單股DNA、雙股DNA、胰島素、脂多糖、KLH及 ⑶4之反應(yīng)性，如ELISA試驗(yàn)之測定；其中所述結(jié)果取自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 本發(fā)明首次證實(shí)經(jīng)由可變區(qū)的聚糖修飾可改進(jìn)單克隆抗體之功能。具體而言，本 發(fā)明發(fā)現(xiàn)移植聚糖類至一抗-CD4單克隆抗體之輕鏈可變區(qū)可復(fù)原一抗體與HIV之間的糖 媒介交互作用，因此該具有聚糖修飾的抗體可有效抑制病毒分尚株的感染，該病毒分尚株 在正常情況下可逃脫親本抗體分子活性（無聚糖修飾）。
[0045] 據(jù)此，本發(fā)明提供聚糖修飾的抗-CD4單克隆抗體、用于生產(chǎn)此類抗體的組分如表 達(dá)載體及細(xì)胞株，以及此類抗體于HIV預(yù)防及治療之用途。
[0046] 定義
[0047] 本文使用的術(shù)語「抗原」是指含有一個(gè)或一個(gè)以上的表位的分子，且其可引發(fā)免疫 反應(yīng)。本文使用的術(shù)語「抗原性分子」在一般意義上是指可作為本發(fā)明所公開的聚糖修飾 蛋白質(zhì)的結(jié)合標(biāo)的的分子。
[0048] 本文使用的術(shù)語「表位」，亦稱作抗原決定簇，是指抗原性分子的一部分或可被免 疫系統(tǒng)（亦即，B細(xì)胞、T細(xì)胞或抗體）所辨識的分子。表位可以是一構(gòu)象表位或一線性表 位。一構(gòu)象表位是由抗原分子的不連續(xù)區(qū)段組成，或由多個(gè)分子組成。在抗原為蛋白質(zhì)的 情況中，構(gòu)象表位可由該相同蛋白質(zhì)分子的不連續(xù)胺基酸殘基組成，或由該蛋白質(zhì)的不同 分子的胺基酸殘基組成（例如，由蛋白質(zhì)多聚體所組成的四級表位）。一線性表位由抗原的 連續(xù)區(qū)段組成，例如，蛋白質(zhì)抗原的胺基酸的連續(xù)序列。
[0049] 本文所使用的術(shù)語「抗體」廣泛地包括完整的抗體分子，其包括具有想要的活性或 功能的完整的多克隆、單克隆、單特異性、多特異性、嵌合、人源化、人類、靈長類、單鏈、單結(jié) 構(gòu)域、合成型與重組型抗體以及抗體片段。
[0050] 本文所使用的術(shù)語「抗體片段」具體而言包括完整抗體的抗原結(jié)合片段。抗原結(jié) 合片段的實(shí)例包括但不限于Fab片段（由VL、VH、CL與CH1結(jié)構(gòu)域組成）、Fab'片段（其 不同于Fab片段的地方是CH1結(jié)構(gòu)域之C端具有額外少數(shù)殘基，包括抗體鉸鏈區(qū)（hinge region)的一個(gè)或一個(gè)以上的半胱胺酸）、（Fab'） 2片段（由二個(gè)Fab'片段組成，其中鉸鏈 區(qū)以雙硫鍵相連接）、Fd片段（由VH與CH1結(jié)構(gòu)域組成）、Fv片段（是指一重鏈與一輕鏈 的可變結(jié)構(gòu)域之二聚體，其以緊密、非共價(jià)方式連接，并含有完整的抗原辨識和結(jié)合位置）、 dAb片段（由VH結(jié)構(gòu)域組成）、單一結(jié)構(gòu)域片段（VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域、VHH結(jié)構(gòu)域、或VNAR 結(jié)構(gòu)域）、分離的⑶R區(qū)、scFv (或「單鏈Fv」，是指VL與VH結(jié)構(gòu)域的融合物，其經(jīng)由一連接 符連接），以及其他保留抗原結(jié)合功能的抗體片段。
[0051] 本文使用的術(shù)語「可變區(qū)」是指抗體的抗原結(jié)合區(qū)，其在不同的抗體分子間具有很 大的差異。未以相同方式變化的抗體區(qū)域且通常具有免疫系統(tǒng)效應(yīng)子（effector)的功能 者，稱作「恒定區(qū)」。免疫球蛋白鏈（成熟型）的大約前面110個(gè)胺基酸構(gòu)成其可變結(jié)構(gòu)域。 重鏈的二個(gè)可變結(jié)構(gòu)域（variable domains of the heavy chain，VH)及輕鏈的二個(gè)可變 結(jié)構(gòu)域（variable domains of the light chain，VL)構(gòu)成抗體可變區(qū)。重鏈的六個(gè)恒定 結(jié)構(gòu)域（constant domains of the heavy chain，與 CH 3)和輕鏈的二個(gè)恒定結(jié)構(gòu) 域（constant domains of the light chain，CL)構(gòu)成抗體恒定區(qū)。
[0052] 本文使用的術(shù)語「⑶R」或「互補(bǔ)性決定區(qū)」是指抗體可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)的高度可變區(qū)。 重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域各有三個(gè)CDRs，并由負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的胺基酸殘基所組成。本文使用 的術(shù)語「框架區(qū)」或「FR(framework region)」是指可變結(jié)構(gòu)域的更具保留性的部位，且是 由高度可變區(qū)殘基以外的殘基組成。
[0053] 本文使用的術(shù)語，抗體的「抗原結(jié)合位置」是指由一結(jié)合至抗原之抗體的胺基酸組 成的構(gòu)象和/或構(gòu)造。舉例而言，每一 VH與VL結(jié)構(gòu)域的三個(gè)CDRs可交互作用以在VH-VL 二聚體（dimer)表面上定義一抗原結(jié)合位置?？傊?，所述六個(gè)CDRs使抗體具有抗原結(jié)合的 特異性。然而，應(yīng)注意的是，一單一可變結(jié)構(gòu)域（亦即，VH或VL)亦可辨識及結(jié)合抗原，盡 管其功效低于全部六個(gè)CDRs位置的結(jié)合。
[0054] 本文使用的術(shù)語「嵌合抗體」是指含有取自不同來源之多肽的抗體，例如，不同物 種或不同抗體類型或子類型。嵌合抗體的實(shí)例包括以鼠單克隆抗體的抗原結(jié)合部位融合至 人類免疫球蛋白的Fc片段。嵌合抗體的制造方法是本技術(shù)領(lǐng)域習(xí)知的；例如，Boss等人于 美國專利號4, 816, 397及Cabilly等人于美國專利號4, 816, 567所公開的方法。
[0055] 本文使用的術(shù)語「人源化抗體」是指在人類免疫球蛋白骨架或框架中含有非人類 序列要素的抗體。一般而言，人源化抗體是人類免疫球蛋白（受體抗體），其受體的高度可 變區(qū)（CDRs)殘基是由非人類物種（供體抗體）的高度可變區(qū)殘基取代，所述非人類物種包 括具有想要的特異性、親合性和能力的小鼠、大鼠、兔子或非人類的靈長類。在某些情況中， 人類免疫球蛋白的框架區(qū)（FR)殘基亦可被非人類殘基取代。在某些情況中，人源化抗體 亦可含有未出現(xiàn)在受體抗體或供體抗體的殘基，并可導(dǎo)入殘基以進(jìn)一步調(diào)整抗體性能。一 般而言，一人源化抗體實(shí)質(zhì)上包含所有至少一個(gè)，且典型地二個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或?qū)?質(zhì)上所有的高度可變區(qū)相對應(yīng)于那些非人類免疫球蛋白及所有或?qū)嵸|(zhì)上所有的框架區(qū)是 那些人類免疫球蛋白序列。一人源化抗體亦可選地含有至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū) (Fc)，典型地如人類免疫球蛋白。人源化抗體之制造方法如本技術(shù)領(lǐng)域之文獻(xiàn)所示；請見， 例如，Winter之美國專利號5, 225, 539及Boss等人之美國專利號4, 816, 397。
[0056]本文使用的術(shù)語「非人類靈長類抗體」是指在非人類靈長類免疫球蛋白骨架或框 架中含有人類序列要素或非靈長類序列要素的抗體。舉例而言，非人類靈長類抗體可由非 人類靈長類免疫球蛋白（受體抗體）所制備，其藉由人類或非靈長類物種，例如，具有想要 的特異性、親合性和能力之小鼠、大鼠或兔子的供體抗體高度可變區(qū)殘基取代其受體抗體 高度可變區(qū)（CDRs)殘基?；蛘?，藉由使用具有人類或非靈長類序列或不同靈長類物種序列 的受體免疫球蛋白及將想要的靈長類Fc片段及/或殘基（包括具體而言框架區(qū)殘基）導(dǎo) 入受體免疫球蛋白，以將非人類靈長類抗體制成適合給藥于想要的靈長類物種的抗體。非 人類靈長類抗體的實(shí)例包括本文實(shí)施方式一節(jié)所公開的「猴源化」抗體。
[0057]本文使用的術(shù)語「單特異性抗體」是指辨識及結(jié)合至一表位的抗體。
[0058] 本文使用的術(shù)語「多特異性抗體」是指由至少二個(gè)單獨(dú)抗體組成并結(jié)合至多個(gè) (亦即，二或多個(gè)）單獨(dú)表位的抗體。
[0059]本文使用的術(shù)語「中和性抗體」是指抗體可抑制、降低或完全預(yù)防HIV-1感染?？?藉由以下實(shí)施方式一節(jié)所述之體外試驗(yàn)測定一抗體是否為中和性抗體。
[0060]本文使用的術(shù)語「有效中和性抗體」是指一抗體以低濃度使用時(shí)，可減少至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多的111￥-1感染。濃度低于501^/1111、介于1 與50 y g/ml之間、或甚至低于1 y g/ml者，皆視為「低濃度」。在一些【具體實(shí)施方式】中，低 濃度為濃度位于皮莫耳（picomolar)范圍者，例如10-900ng/ml，并包括此范圍內(nèi)之任何濃 度，例如 800、700、600、500、400、300、200、100、75、50、25、10邱/1111，或甚至低于101^/1111。
[0061]本文使用的術(shù)語「廣域中和性抗體」是指一抗體對于HIV-1感染的抑制可達(dá)到所 定義的體外50%感染抑制，甚至可抑制高于50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、或更 高之一大組（大于l〇〇)HIV-l包膜假型病毒與病毒分離株；舉例而言，一大組分離株代表包 膜具有地域、分化、向性及感染階段等多樣性。
[0062]本文所使用的術(shù)語「片段」是指生物分子一級結(jié)構(gòu)的實(shí)際連續(xù)部分。在蛋白質(zhì)的情 況中，一片段可定義為蛋白質(zhì)胺基酸序列的連續(xù)部分并可為至少3-5個(gè)胺基酸、至少6-10 個(gè)胺基酸、至少11-15個(gè)胺基酸、至少16-24個(gè)胺基酸、至少25-30個(gè)胺基酸、至少30-45個(gè) 胺基酸及至多為所述蛋白質(zhì)之全長減去數(shù)個(gè)胺基酸。在多核苷酸的情況中，一片段被定義 為多核苷酸的核酸序列的連續(xù)部分并可為至少9-15個(gè)核苷酸、至少15-30個(gè)核苷酸、至少 31-45個(gè)核苷酸、至少46-74個(gè)核苷酸、至少75-90個(gè)核苷酸，及至少90-130個(gè)核苷酸。在 某些【具體實(shí)施方式】中，生物分子的片段為免疫原性片段（immunogenic fragments)。
[0063]本文使用的術(shù)語「融合蛋白」是指二或多個(gè)不同來源的勝肽經(jīng)由連接符彼此相連。 舉例而言，一融合蛋白可包括一蛋白質(zhì)連接至一抗體。其他實(shí)例包括一抗體連接至一不同 抗體或一抗體連接至一 Fab片段。該Fab片段可連接至抗體的重鏈或輕鏈的N端或C端， 或抗體內(nèi)的其他區(qū)域。
[0064] 「勝肽」是以酰胺（勝肽）鍵連接二或多個(gè)胺基酸所組成的任何化合物，通常是 a_胺基酸之聚合物，其中每一胺基酸殘基的a_胺基（除了 NH2端以外）以直鏈形式連接 至下一殘基之a(chǎn)-羧基。本文所使用的勝肽、多肽和聚（胺基酸）等術(shù)語皆同義地意指此 類化合物而未局限其分子量大小，除非有另外說明。此類別之成員具有大分子量者也稱作 蛋白質(zhì)并可包括抗體。
[0065] 聚糖修飾的抗-⑶4單克隆抗體
[0066] 本文所公開的聚糖修飾方法可應(yīng)用于抗-CD4單克隆抗體，其可為單特異性、多特 異性、嵌合、人源化、人類、非人類靈長類、單鏈、及/或單一結(jié)構(gòu)域抗體之單克隆抗體。本發(fā) 明之方法亦可應(yīng)用于抗-CD4單克隆抗體之片段，尤其是抗-CD4單克隆抗體之抗原結(jié)合片 段。
[0067] 抗-⑶4抗體已在本技術(shù)領(lǐng)域中描述且亦可容易產(chǎn)生，這是因?yàn)棰?受體的蛋白質(zhì) 序列是本領(lǐng)域的技術(shù)人員習(xí)知的。CD4具有四個(gè)位于細(xì)胞外表面的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域（D1 至D4)，并以其D1結(jié)構(gòu)域與主要組織兼容性復(fù)合體（major histocompatibility complex， MHC)第二型分子之02結(jié)構(gòu)域交互作用。在某些【具體實(shí)施方式】中，該抗-⑶4抗體結(jié)合至一 個(gè)或一個(gè)以上的DUD1-D2連結(jié)區(qū)、D2、D2之BC或FG環(huán)狀結(jié)構(gòu)，或其任何結(jié)合物。在特定具 體實(shí)施方式中，本發(fā)明所公開的抗-CD4抗體主要針對所述CD4受體的類第二免疫球蛋白結(jié) 構(gòu)域（D2)(胺基酸位置98-180)。CD4的D2結(jié)構(gòu)域的抗體具有想要的阻斷HIV感染的特性 而不會干擾⑶4與主要組織兼容性復(fù)合體（MHC)第二型分子交互作用所媒介之免疫功能。 在其他【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明所使用的抗-CD4抗體結(jié)合至位于CD4受體D1-D2連結(jié)區(qū)附 近的D2的BC環(huán)狀結(jié)構(gòu)（胺基酸121-127)之表位。又其他【具體實(shí)施方式】中，該抗-⑶4抗 體結(jié)合至D2的FG環(huán)狀結(jié)構(gòu)（胺基酸163-165)及部分D1 (胺基酸77-96)。該胺基酸編號 對應(yīng)于成熟型CD4受體的位置，但不包括信號肽。該人類CD4受體之胺基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，其中胺基酸1-25代表一信號肽、胺基酸26-122構(gòu)成D1，以及胺基酸123-205構(gòu) 成D2。
[0068] -特定【具體實(shí)施方式】中，該抗-⑶4單克隆抗體為人源化抗體ibalizumab或 「iMab」（先前稱作 TNX-355 或 hu5A8)。Ibalizumab 有效地阻斷一廣譜（broad spectrum) 的HIV-1分離株感染并標(biāo)靶一位于⑶4受體D1-D2連結(jié)區(qū)附近的D2的BC環(huán)狀結(jié)構(gòu)的表位， 而不會干擾⑶4與主要組織兼容性復(fù)合體（MHC)第二型分子交互作用所調(diào)節(jié)的免疫功能。 所述抗-CD4抗體之一實(shí)例在美國專利申請?zhí)?, 871，732提供，在此全部通過引用并入本案 以作為參考文獻(xiàn)。
[0069]另一【具體實(shí)施方式】中，該抗-CD4抗體或其片段為具有改善的穩(wěn)定性的 ibalizumab突變體。一實(shí)施方式為該抗-⑶4抗體之鉸鏈區(qū)具有一個(gè)或一個(gè)以上的取 代，其可防止鏈內(nèi)雙硫鍵形成，而所得的抗體分子具有令人驚訝地增進(jìn)的二價(jià)穩(wěn)定性，如 W02008134046(A1)所公開，其于2007年4月27日公開，在此通過引用并入本案以作為參考 文獻(xiàn)。
[0070] 根據(jù)本發(fā)明之【具體實(shí)施方式】，所述抗-⑶4抗體可由IgG 4或IgG 1所產(chǎn)生。在 本發(fā)